[發明專利]一株組成型表達精氨酸酶的基因工程菌株及其應用

無效

• 申請號: 201210177959.3
• 申請日: 2012-06-01
• 公開（公告）號: CN102703370A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 張奇;楊潔;李鳴;白芳;白鋼
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/10;C12R1/19
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發明涉及基因工程和蛋白質的表達領域，尤其涉及組成型表達酶的工程菌株的構建，同時本發明也屬于生物技術生產氨基酸的技術領域，涉及通過組成型表達的酶來制備L-鳥氨酸及D-精氨酸的方法。

背景技術

L-鳥氨酸學名為α,δ-二氨基戊酸，不參與人體內蛋白質合成，但具備極其重要的生理功能。L-鳥氨酸存在于生物體多種組織和細胞中，在生物體代謝中起到重要作用，是尿素生成的中間產物，參與產尿素的鳥氨酸循環，也是精氨酸、瓜氨酸等多種氨基酸代謝的前體物質，具有解毒作用，對人體肝臟細胞具有重大意義。

D-精氨酸是一種非蛋白質氨基酸，天然原料人工合成，研究表明D-精氨酸具有抗高血壓的功效；D-精氨酸的重要生理功能還表現在可抑制癌癥擴散，以及治療生長激素過多釋放造成的紊亂等方面。

L-鳥氨酸的制備方法包括化學合成法、直接發酵法和水解精氨酸法等幾種方法。

水解精氨酸法包括堿水解法和酶水解法，其中，酶水解法具有很強的專一性，其反應過程簡單，副產物少，反應條件溫和，并且避免使用氰化氫等有毒化學品，底物轉化率高，生成的L-鳥氨酸純度高，利于后續分離，因此利用精氨酸作為底物，在精氨酸酶的催化下生成L-鳥氨酸的酶水解方法受到廣泛的重視，是目前國內廠家生產L-鳥氨酸的常用方法。

Makryaleas等人研究了精氨酸酶水解精氨酸制備L-鳥氨酸的方法，在pH?8.0～10.0時轉化率可高達99%。2005年，焦慶才等對L-精氨酸酶固定化生產L-鳥氨酸進行了研究，L-精氨酸的轉化率達到95%，并且采用該種固定化酶法相對于傳統酶法水解，在產物與催化劑的分離和工業化生產的連續控制等方面具有明顯的優勢。張鵬等利用糞腸球菌產生的精氨酸酶轉化生產L-鳥氨酸，產量可高達112g/L，轉化率高達99.5%。

目前，D-精氨酸的制備方法主要為酶法制備，即以L-精氨酸為原料,經消旋反應得到DL-精氨酸。李加友和曹瑜等利用糞鏈球菌的精氨酸脫亞胺酶對L-精氨酸的專一脫亞胺作用來生產D-精氨酸，D-精氨酸的產率為87%，附加產物L-瓜氨酸的產率為88%。

現有的生物酶法轉化盡管可達到一定高的轉化率，但精氨酸酶在制備的過程中大多是需要加入誘導劑，成本較高。

發明內容

本發明的目的是構建一株組成型表達精氨酸酶的基因工程菌株，使得在精氨酸酶發酵生產中無需加入誘導劑，以縮短發酵周期，降低誘導物、能耗等成本；同時，組成型表達相對于誘導表達更穩定，克服了誘導表達過程中菌株易退化、質粒易丟失的缺陷，為酶法拆分DL-精氨酸生產L-鳥氨酸及D-精氨酸和轉化L-精氨酸生產L-鳥氨酸提供了綠色環保高效的生產方法。

本發明提供的組成型表達精氨酸酶的基因工程菌株，是在本實驗室已經構建的能夠誘導表達精氨酸酶的重組表達載體pET21a(+)-ARG基礎上，通過自殺質粒pRE112，構建重組載體pRE112-ARG，將其轉化至不能表達π蛋白的宿主細胞E.coli?DH5α，并通過氯霉素（Cm）抗性篩選，獲得的組成型表達精氨酸酶的基因工程菌株E.coli?DH5α-ARG。隨后對組成型表達的精氨酸酶的酶促反應條件進行了初步研究，為酶法制備L-鳥氨酸和D-精氨酸的生產工藝奠定了基礎。

所述的自殺質粒pRE112與宿主細胞染色體發生重組，使精氨酸酶I基因可組成型表達。所述的自殺質粒pRE112的復制及轉化載體的制備和篩選在E.coli?S17λpir^A宿主細胞進行。

本發明提供的構建組成型表達精氨酸酶工程菌的方法，具體包括：

（1）將精氨酸酶I基因插入到自殺質粒pRE112的多克隆位點，構建重組質粒pRE112-ARG;

(2)將重組質粒轉化至宿主菌E.coli?S17λpir^A，篩選陽性克隆并鑒定；

（3）將篩選的陽性菌株培養，提取質粒，并轉化至E.coli?DH5α，于Cm/LB平板培養，篩選陽性克隆；

（4）菌落PCR鑒定后進行酶活測定，篩選高精氨酸酶活性的菌株，即E.coli?DH5α-ARG。該菌株與實驗室保存的誘導型表達的菌株相比，酶活力沒有顯著性差異。

本發明同時涉及組成型表達精氨酸酶的基因工程菌E.coli?DH5α-ARG在L-鳥氨酸和D-精氨酸制備中的應用。