[發明專利]基于基因芯片的水體中13種病原微生物同步快速檢測方法

無效

• 申請號: 201210172852.X
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102703589A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 方振東;張春秀;謝朝新;敖漉;王大勇;馬穎;陳金絲
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍后勤工程學院;上海生物芯片有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/10;C12Q1/04
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

1.一種基于基因芯片的水體中13種病原微生物同步快速檢測方法，所述方法是采用多重PCR同時擴增病原微生物的特異性基因片段，再通過基因芯片雜交和芯片掃描圖像分析，獲得檢測結果；所檢測的13種病原微生物包括：大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7、嗜肺軍團菌、腸炎沙門菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、幽門螺旋桿菌、結核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌和鼠疫耶爾森菌。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述方法具體包括以下步驟：

（1）水樣處理

采集水樣，用無菌塑料瓶封裝，室溫靜置，取上清液加入濃縮儀進行濃縮集菌，然后抽干濾膜，取出放入離心管內，剪成細末狀；

（2）DNA模板提取

采用E.Z.N.A.Bacterial?DNA?Kit（D3350-01）試劑盒，或者具有同等作用的其他商業化DNA提取試劑盒提取樣本的DNA，取10uL樣本DNA進行下一步程序；

（3）多重PCR擴增目的片段

采用15μL的PCR體系，包括10×PCR?Taq酶緩沖液1.0－2.0μL，濃度為2.5?mmol/L?的dNTP0.1－0.3μL，引物各0.4－0.8μL，濃度為10－20μmol/L，50×T-Taq?DNA聚合酶0.1－0.5μL，DNA模板0.5－1.5μL，雙蒸水補至15μL；所述引物是指13種病原微生物的引物；

PCR循環參數：95℃預變性3?min，接著作30個循環，每個循環包括94℃變性30s，68℃退火并延伸30s；循環結束后68℃延伸5?min；產物4℃保存備用；

（4）樣本標記：

采用單堿基延伸標簽反應（SBE-tags）進行；15μL的?SBE-tags反應體系含10×Reaction?Buffer?1.0－2.0μL，SBE-tags引物（10－20μmol/L）0.4－0.8μL，濃度為10μmol/L?的Cy3-ddATP?0.1－0.5μL，活性濃度為5?U/μL?的Sequencing多聚酶?0.1－0.5μL，多重PCR純化產物2－6μL，雙蒸水補至15μL；循環參數：96℃預變性3min，接著作36個循環，每個循環包括96℃變性30?s，60℃退火30s，72℃延伸20?s；循環結束后在72℃延伸5?min；

標記產物避光保存于4℃；

（5）芯片雜交與洗片

芯片雜交前使用預雜交液進行預處理1h以去除玻璃基片上多余的活性醛基基團，之后將SBE產物、熒光質控探針和雜交緩沖液加入，在48℃雜交2?h，雜交結束后洗片，除去芯片上未雜交上的成分；

（6）?芯片掃描，根據掃描結果，進行圖像分析，判斷樣本中所含有的微生物種類。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述基因芯片可同時檢測水體中13種致病微生物，芯片上同時含有陽性質控位點、陰性質控位點、以及空白對照等位點；所述芯片的所有探針在5’端均修飾有氨基。

4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述芯片在進行預雜交處理之后，進行熒光標記的樣本雜交，雜交完成后洗滌、甩干，進行芯片掃描，分析掃描圖像，確定樣本中含有的微生物種類。