[發明專利]基于多重PCR的水中13種病原微生物同步快速檢測方法

無效

• 申請號: 201210172849.8
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102703588A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 方振東;張春秀;謝朝新;敖漉;王大勇;馬穎;陳金絲
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍后勤工程學院;上海生物芯片有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12Q1/14;C12Q1/10
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

技術領域

本發明屬于環境科學與工程、環境保護技術領域。

背景技術

現階段國內外常用于檢測和鑒定致病微生物的方法主要有傳統生化鑒定法、免疫學檢測技術、常規PCR等一些簡單的分子生物學和免疫學方法。

傳統生化鑒定法（如分離培養、生化鑒定等）應用最廣泛，是《食品衛生微生物學檢驗（GB/T?4789-2003）》等國標檢測程序，該方法能夠得到樣品中細菌數量和特性等方面的定性及定量結果，由于操作簡單、經濟且準確性好而被廣泛采用，但是大都需要經過前增菌、增菌、選擇性平板分離、生物化學試驗和血清學分型鑒定4個步驟，整個過程通常需要3~7天，檢測周期長，并且要求所要檢測的細菌增殖為可見菌落，另外，培養基制備、細菌培養、菌落計數和生化指標的檢測都增加了實驗室的工作量，并且檢測靈敏度低，不能實現有效的實時快速監測和防控。

免疫學檢測技術主要是采用酶聯免疫分析（Enzyme-Linked?Immunosorbent?Assay，ELISA），ELISA是把抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機地結合起來的一種檢測技術，既可測抗原，也可測抗體，可進行定性和定量測定，基本原理是預先結合在固相載體上的抗體或抗原分子與樣品中的抗原或抗體分子在一定條件下進行免疫學反應。該方法可檢測沙門氏菌、軍團菌、大腸桿菌O157等致病微生物。免疫學檢測技術簡單、方便，較傳統檢測技術迅速，但存在交叉反應比較嚴重、假陽性多、靈敏度偏低等不足之處。

聚合酶鏈式反應（Ploymerase?Chain?Reaction，PCR）是一種體外核酸擴增技術，其基本原理是在體外適宜的條件（如鎂離子濃度）和Taq?DNA聚合酶的作用下，利用游離的脫氧核糖核苷酸（dNTP），以目標基因組DNA上正、反相兩引物間的特定的雙鏈DNA片段（或稱靶DNA）進行高效擴增，故又稱基因體外擴增法。一般的PCR需要經過預變性，變性、退火、延伸的25~35次循環，可將靶DNA序列擴增近百萬倍，經瓊脂糖或聚丙烯酰氨凝膠電泳和染色劑如溴化乙錠（EB）染色后在紫外光下觀測到相應的條帶。常規PCR雖為一種特異靈敏、簡便快速的檢測技術，但該方法需要較長時間的樣品純化處理過程，且一旦有極少量外源性DNA污染，就可能出現假陽性結果；多對引物同時擴增，各種實驗條件控制不當，很容易導致擴增失敗或非特異性產物；引物的設計及靶序列的選擇不當等都可能降低其靈敏度和特異性；同時，一次一般只能檢測一種致病微生物。

發明內容

本發明的目的是針對現有檢測和鑒定致病微生物方法存在的以上不足，提出一種基于多重PCR的水中13種病原微生物同步快速檢測方法。

本發明的技術方案如下：

一種基于多重PCR的水中13種病原微生物同步快速檢測方法，采用多重PCR一次性同時擴增13種致病微生物的特異性基因片段：大腸埃希菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7、嗜肺軍團菌、腸炎沙門菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、幽門螺旋桿菌、結核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌和鼠疫耶爾森菌，再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

所述方法具體包括以下步驟：

（1）?水樣處理

采集水樣，用無菌塑料瓶封裝，室溫靜置，取上清液加入濃縮儀進行濃縮集菌（濃縮儀采用Milliflex?Plus濃縮儀），然后抽干濾膜，取出放入離心管內，剪成細末狀；

（2）DNA模板提取

采用E.Z.N.A.Bacterial?DNA?Kit（D3350-01）試劑盒或者與之有同等作用的其他商業化DNA提取試劑盒進行核酸提取，取10uL樣本DNA進行下一步程序；

（3）多重PCR擴增目的片段

采用15μL的PCR體系，包括10×PCR?Taq酶緩沖液1.0－2.0μL，濃度為2.5?mmol/L?dNTP??0.1－0.3μL，濃度為10－20μmol/L的各種（即13種病原微生物）引物混合液0.4－0.8μL，50?×T-Taq?DNA聚合酶0.1－0.5μL，DNA模板0.5－1.5μL，雙蒸水補至15μL；?

PCR循環參數：95℃預變性3?min，接著作30個循環，每個循環包括94℃變性30s，68℃退火并延伸30s；循環結束后68℃延伸5?min；4℃保存備用；

（4）電泳檢測