[發明專利]一種胎兒表觀遺傳學標志物及其應用

無效

• 申請號: 201210168768.0
• 申請日: 2012-05-28
• 公開（公告）號: CN102676513A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 鄭芳;榮媛;張元珍;高嘉嘉;楊娜;劉松梅
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 薛玲

技術領域

本發明涉及無創性產前診斷領域，具體涉及一種胎兒表觀遺傳學標志物，還涉及該表觀遺傳學標志物的用途。

背景技術

孕婦血漿中存在的胎兒游離核酸首先于1997年由Lo?YMD等人發現[Lo?YMD，Corbetta?N，Chamberlain?PF，et?al.Presence?of?fetal?DNA?in?maternal?plasma?and?serum.Lancet，1997，350:485–487.]，但由于血漿胎兒游離DNA畢竟只占母血漿游離DNA的3-6%，為了將胎兒遺傳物質從母親來源的游離DNA的強大背景中相區分并應用于胎兒無創性產前診斷，胎兒游離表觀遺傳學標志物應運而生。

基于胎盤組織和外周血DNA差異甲基化的研究，以及胎盤組織是孕婦血漿中游離胎兒核酸的重要來源，而孕婦血漿中母體DNA則主要來源于造血細胞作為理論依據依據[Alberry?M,Maddocks?D,Jones?M?et?al.Free?fetal?DNA?in?maternal?plasma?in?anembryonic?pregnancies:confirmation?that?the?origin?is?the?trophoblast.Prenatal?Diagnosis?200727:415-18；Lui?YYN，Chik?K-W，Chiu?RWK?et?al.Predominant?hematopoietic?origin?of?cell-free?DNA?in?plasma?and?serum?after?sex-mismatched?bone?marrow?transplantation.Clinical?Chemistry?200248,421-27]。胎兒表觀遺傳學標志物在妊娠早期和晚期其甲基化狀態沒有發生改變，對于無創性產前診斷唐氏綜合征而言是一個重要的候選遺傳學標志物。截至目前為止，尚沒有21號染色體特異的游離胎兒DNA表觀遺傳學標志物用于臨床實際無創性產前診斷的研究報道。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種方法用于檢測位于21號染色體上位于唐氏綜合癥關鍵區域的新的胎兒表觀遺傳學標志物。

本發明運用甲基化敏感性限制性核酸內切酶-PCR（Methylation-sensitive?Restriction?Enzyme，MSRE-PCR）技術，進行差異甲基化位點的篩選，并將篩選出的差異甲基化位點采用重亞硫酸鹽轉化克隆測序技術進一步驗證，收集孕婦血漿以及未孕婦女血漿并提取游離DNA，甲基化敏感性核酸內切酶Hin6I消化作用后，運用實時熒光定量PCR進行胎兒表觀遺傳標記的檢測以及定量，發現了出一個新的胎兒表觀遺傳學標志物，高甲基化的TSPEAR(hypermethylated?TSPEAR,M-TSPEAR)標志物位于21號染色體的唐氏綜合癥關鍵區域（Downs?syndrome?critical?region,DSCR）,與胎兒性別無關,可以通過甲基化敏感性核酸內切酶消化將孕婦血漿游離核酸中母體和胎兒DNA區分開來，易于在臨床上進一步應用。

具體地，本發明所涉及的胎兒表觀遺傳學標志物，其為SEQ?ID?No.1所示的DNA，或者該DNA的特異性片段，所述特異性片段至少包括SEQ?ID?No.1的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位點堿基中的至少一個。

通過檢測上述位點的甲基化狀況，可以將孕婦血漿游離核酸中母體和胎兒DNA區分開來的。

檢測上述甲基化位點的方法包括但不限于：甲基化特異性PCR，甲基化敏感性單核苷酸引物延伸，甲基化敏感性單鏈構象分析，甲基化敏感性解鏈曲線分析，結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法，DNA微陣列法，甲基化特異性多重連接依賴性探針擴增等技術。

本發明還提供一種用于檢測上述表觀遺傳學標志物的引物，該引物能特異性擴增上述的遺傳標志物，引物的設計可以采用本領域常規的設計方法。本發明提供的試劑盒進一步包括甲基化敏感性核酸內切酶，該內切酶的識別序列至少包括SEQ?ID?No.1序列中的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位點之一。

在本發明的一個實施例中，所述引物為：正義引物:5’-CCACGGCCCGGTGCCT-3’反義引物:5’-TGGGAAGCACAGGCGCG-3’；其還包括TaqMan探針：5’-FAM-CACGCGCACAGCGACAC-3’-BHQ1。所述內切酶為Hin6I。