[發(fā)明專利]PABP抑制劑在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥物中的應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210165822.6
• 申請(qǐng)日: 2012-05-24
• 公開（公告）號(hào): CN102698289A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜平;王曉曄;李玉峰;王先煒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;C12N15/85;A61P31/14
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及PABP抑制劑在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥物中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）N蛋白是由ORF7編碼的一個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒核衣殼的唯一蛋白成分。N蛋白具有的核定位序列，不僅使N蛋白可以自由穿越核膜進(jìn)入細(xì)胞核，而且能明顯影響病毒毒力的強(qiáng)弱。PRRSV?N蛋白在病毒感染過程中扮演了雙重角色：在細(xì)胞質(zhì)中是結(jié)構(gòu)蛋白而在細(xì)胞核中則如同非結(jié)構(gòu)蛋白一般。研究顯示，冠狀病毒、風(fēng)疹病毒以及與PRRSV同屬尼多病毒目的馬動(dòng)脈炎病毒（EAV）等病毒的核衣殼蛋白都能與宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白發(fā)生相互作用，影響一系列蛋白的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制，暗示了PRRSV?N蛋白也會(huì)存在這種類似的現(xiàn)象。?

酵母雙雜交篩選常常用來探索未知蛋白質(zhì)相互作用，我們使用酵母雙雜交篩選來尋找與PRRSV?N蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白。?

RNA干擾介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)可以部分地抑制特定內(nèi)源基因的表達(dá)。RNA干擾技術(shù)在預(yù)防獸醫(yī)學(xué)上廣泛應(yīng)用于靶向病原核酸的某一特定區(qū)域，從而抑制病原的復(fù)制。RNA干擾技術(shù)也常用來降低宿主細(xì)胞某種特定蛋白的表達(dá)，從而建立研究此蛋白與病毒復(fù)制關(guān)系的細(xì)胞模型。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供PABP抑制劑在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥物中的應(yīng)用。?

本發(fā)明的另一目的是提供一種干擾PABP表達(dá)的miRNA。?

本發(fā)明的又一目的是提供該miRNA的應(yīng)用。?

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：?

PABP蛋白抑制劑在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥物中的應(yīng)用，其中所述的PABP蛋白GeneBank登錄號(hào)為:XM_001927747.1。?

所述的PABP蛋白抑制劑為表達(dá)PABP?shRNA的重組質(zhì)粒。?

所述的表達(dá)PABP?shRNA的重組質(zhì)粒以pSUPER為出發(fā)載體，含有表達(dá)PABP?shRNA的DNA模板序列。?

所述的表達(dá)PABP?shRNA的DNA模板序列系由SEQ?ID?No.9所示的寡核苷酸正義鏈和SEQ?ID?No.10所示的寡核苷酸反義鏈序列組成。?

一種抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒表達(dá)的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于以pSUPER為出發(fā)載體，含有可表達(dá)PABP?shRNA的DNA模板序列。?

所述的可表達(dá)PABP?shRNA的DNA模板序列系由SEQ?ID?No.9所示的寡核苷酸正義鏈和SEQ?ID?No.10所示的寡核苷酸反義鏈序列組成。?

有益效果：?

本發(fā)明根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）N蛋白在病毒復(fù)制過程中的多功能作用和多重角色，以及根據(jù)病毒衣殼蛋白往往能夠與宿主細(xì)胞的蛋白成分發(fā)生相互作用，作出PRRSV?N蛋白也有類似作用的假設(shè)。利用酵母雙雜交技術(shù)，在成功構(gòu)建豬肺泡巨噬細(xì)胞cDNA文庫及含有PRRSV?ORF7全長基因誘餌質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，成功篩選出包括PABP在內(nèi)的一系列能夠與N蛋白發(fā)生相互作用的宿主蛋白質(zhì)，并通過免疫學(xué)方法和激光共聚焦顯微觀察技術(shù)對(duì)PABP與PRRSVN蛋白相互作用的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。?

本發(fā)明成功構(gòu)建并篩選了以pSUPER為載體，可以表達(dá)靶向PABP的小發(fā)卡RNA的重組質(zhì)粒。將這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Marc-145細(xì)胞后接種PRRSV，與轉(zhuǎn)染不能夠靶向干擾PABP表達(dá)的重組質(zhì)粒的對(duì)照組相比較，發(fā)現(xiàn)干擾PABP表達(dá)之后，PRRSV的mRNA水平比對(duì)照組有所下降，免疫熒光結(jié)果顯示N蛋白表達(dá)也比對(duì)照組有所減弱。可見通過抑制PABP表達(dá)，能夠減弱PRRSV?N蛋白的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PRRSV的抑制。?

基于上述研究成果，可見包括本發(fā)明干擾PABP表達(dá)的重組質(zhì)粒在內(nèi)的PABP抑制劑在作為一種新型的抗PRRSV感染的藥物方面具有良好的應(yīng)用前景。?

附圖說明

圖1dscDNA的合成與鑒定?

M1:1kb?DNA?Maker，M2:DL-2000?DNA?Maker，1:ds?cDNA的瓊脂糖凝膠電泳。?

圖2文庫插入片段的PCR鑒定?

M：DL-2000?DNA?Maker，1-10：隨機(jī)挑選的16個(gè)cDNA文庫克隆PCR產(chǎn)物。?

圖3酵母雙雜交篩選得到的陽性克隆在QDO/X/A平板上證實(shí)?