[發(fā)明專利]一種通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導提高棗樹對棗瘋病抗性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210162195.0
• 申請日: 2012-05-24
• 公開（公告）號: CN102676577A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設計）人: 劉孟軍;趙錦;郝征
• 申請（專利權）人: 河北農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
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1.一種通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導提高棗樹對棗瘋病抗性的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）發(fā)根農(nóng)桿菌侵染與轉健苗的獲得??將感染棗瘋病的棗組培苗嫩莖剪成長約1cm的莖段，用OD₆₀₀為0.6-1.0的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染5-15min，然后轉入pH值5.8的共培養(yǎng)基MS+5.5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+200μΜ乙酰丁香酮中共培養(yǎng)3-7d，再轉入pH值5.8的篩選培養(yǎng)基MS+5.5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+100mg/L頭孢曲松鈉中，在25±2℃，光照/黑暗為14/10h的條件下培養(yǎng)60d，篩選出棗瘋病癥狀消失的轉健苗；

（2）轉健苗的脫菌繼代??將轉健苗轉入添加頭孢曲松鈉50-100mg/L、pH值5.8的MS+5.5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+0.2mg/L?BA+0.1mg/L?IBA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每20d換一次培養(yǎng)基，并逐漸降低頭孢曲松鈉的濃度，直到轉健苗完全脫除發(fā)根農(nóng)桿菌，獲得脫菌轉健苗；

（3）脫菌轉健苗的檢測??提取脫菌轉健苗的基因組DNA進行rolC、rolD、tms基因的PCR檢測和棗瘋病病原體的檢測，篩選出攜帶發(fā)根農(nóng)桿菌rolC、rolD、tms基因而不攜帶棗瘋病病原體的轉化苗；

（4）轉化苗對棗瘋病抗性的鑒定??采用組培微嫁接方法，將待鑒定的轉化苗嫁接到瘋組培苗上，嫁接苗在pH值5.8的MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，觀察嫁接苗生長和發(fā)病情況，不發(fā)病的轉化苗說明其抗性得到了提高，即為抗性苗。