[發(fā)明專利]向蘿卜肉質(zhì)根中引入熒光示蹤劑的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210160733.2
• 申請(qǐng)日: 2012-05-22
• 公開（公告）號(hào): CN102680670A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王紹輝;楊瑞;楊柳;程繼鴻;王建立;杜鮮云;房克鳳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/48
• 分類號(hào): G01N33/48;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種向蘿卜肉質(zhì)根中引入熒光示蹤劑的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

蘿卜(Raphanus?sativus?L.)屬于根菜類蔬菜，食用器官為由直根膨大而成的肉質(zhì)根。肉質(zhì)根在外形上分由上胚軸發(fā)育而來(lái)的極短的根頭，即短縮的莖部；由下胚軸發(fā)育而來(lái)的根頸;還有由初生根肥大而成的根部，其上生有很多二列側(cè)根，與子葉展開方向一致。肉質(zhì)根以根頸和根部所占比例最大，其形狀和顏色因品種和栽培條件而不同。蘿卜根的木質(zhì)部最發(fā)達(dá)，其食用部分主要是次生木質(zhì)部的薄壁組織。

蘿卜的“破肚”是蘿卜肉質(zhì)根迅速膨大的標(biāo)志，“破肚”指的是蘿卜肉質(zhì)根的皮層(一個(gè)不發(fā)達(dá)的組織)在中柱的初生組織分化完成以后，皮層及表皮既不分裂亦不膨大，由于中柱組織的生長(zhǎng)發(fā)生向外的壓力，表皮及皮層均破裂而脫落，稱為“破白”或“破肚”，因此在成熟肉質(zhì)根外面包圍著的是一層周皮層。周皮層是由維管束鞘形成的，所以蘿卜的“破白”是表示肉質(zhì)根迅速膨大的象征，此期水肥需要較多。目前對(duì)根菜類蔬菜根莖膨大過(guò)程的顯微觀察報(bào)道較少，迫切需要進(jìn)一步揭示蘿卜肉質(zhì)根膨大的本質(zhì)特征，探索肉質(zhì)根形成過(guò)程結(jié)構(gòu)及同化物運(yùn)輸?shù)南嚓P(guān)規(guī)律。

光合同化物的分配和運(yùn)輸是決定作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，因而研究同化物在庫(kù)組織中的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程就成為一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。關(guān)于有重要經(jīng)濟(jì)性狀的庫(kù)中的同化物代謝的研究，已經(jīng)取得重大進(jìn)展，但是同化物從篩分子卸出到庫(kù)細(xì)胞及其后的一系列過(guò)程，至今還不清楚。一個(gè)重大的障礙就是庫(kù)中維管束深埋在組織內(nèi)部，同庫(kù)組織在結(jié)構(gòu)上很難分離，致使活體卸載體系很難建立。

熒光素CFDA，全稱為5(6)-Carboxyfluorescein?diacetate?Mixed?isomers，是5-和6-羧基代替的熒光素混合物，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，化學(xué)惰性且量子產(chǎn)率高，可長(zhǎng)距離運(yùn)輸，是一個(gè)比較理想的共質(zhì)體標(biāo)記物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種向蘿卜肉質(zhì)根中引入熒光示蹤劑的方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種向蘿卜肉質(zhì)根中引入熒光示蹤劑的方法，包括如下步驟：在蘿卜植株功能葉的葉柄表面制造傷口，然后用2.5mM的EDTA水溶液沖洗所述葉柄，然后采用9-19分鐘將50-200微升熒光素CFDA溶液滴加至所述葉柄上；所述熒光素CFDA溶液中，熒光素CFDA的濃度為1mg/mL。

所述制造傷口的方法具體可為：用砂布摩擦所述葉柄的表皮。

所述方法中，每個(gè)蘿卜植株對(duì)一個(gè)所述功能葉的葉柄表面制造傷口。

所述方法中，所述9-19分鐘具體可為9-14分鐘或14-19分鐘。

所述方法中，所述滴加的頻率具體可為每隔1分鐘滴加1滴，每滴的滴加量具體可為5-10μL（如5-6μL、5-7μL、7-8μL或8-10μL）。

所述熒光素CFDA溶液具體使用稀釋液稀釋熒光素CFDA母液得到的。

所述熒光素CFDA母液的制備方法為：用丙酮溶解熒光素CFDA，使熒光素CFDA的濃度為25mg/mL，得到熒光素CFDA母液；所述稀釋液由Mes-Tris和山梨醇和水組成，Mes-Tris的濃度為5mM，山梨醇的濃度為300mM，所述稀釋液的pH值為5.5。

所述蘿卜的品種具體可為‘北農(nóng)1號(hào)’。

所述蘿卜植株可為從“拉十字”開始計(jì)時(shí)第0至35天間的蘿卜植株。所述蘿卜植株具體可為：從“拉十字”開始計(jì)時(shí)0時(shí)刻的蘿卜植株、從“拉十字”開始計(jì)時(shí)7天后的蘿卜植株、從“拉十字”開始計(jì)時(shí)21天后的蘿卜植株、從“拉十字”開始計(jì)時(shí)28天后的蘿卜植株或從“拉十字”開始計(jì)時(shí)35天后的蘿卜植株。

本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述方法在檢測(cè)蘿卜肉質(zhì)根的同化物卸載中的應(yīng)用。

所述應(yīng)用中，從滴加完所述熒光素溶液開始計(jì)時(shí)，4小時(shí)后將所述蘿卜植株的肉質(zhì)根切片，用熒光顯微鏡進(jìn)行熒光觀察和透射觀察。

所述應(yīng)用中，所述熒光觀察的參數(shù)具體可為：激發(fā)光波長(zhǎng)480nm，發(fā)射光波長(zhǎng)515nm。

所述應(yīng)用中，所述熒光顯微鏡具體可為D-ECLIPSE?C1型共聚焦掃描顯微鏡。

所述應(yīng)用中，具體可分別將不同發(fā)育階段的蘿卜植株進(jìn)行以上任一所述的方法，通過(guò)所述熒光觀察和所述透射觀察判斷蘿卜肉質(zhì)根的同化物卸載過(guò)程。

所述蘿卜的品種具體可為‘北農(nóng)1號(hào)’。