[發明專利]一種改良性能的黃素單核苷酸結合熒光蛋白質

有效

• 申請號: 201210160241.3
• 申請日: 2012-05-22
• 公開（公告）號: CN103421096A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 姚禮山;宋鄉飛;王業飛
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C07K14/32
• 分類號: C07K14/32;C07K14/21
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及的是修飾的熒光蛋白質，具體的來是一種在高溫下有改良性能的黃素單核苷酸結合熒光蛋白質FbFP。

背景技術

綠色熒光蛋白質和其衍生物需要氧氣來合成其生色團(Tsien，R.Y.Annu?Rev?Biochem?1998，67，509.)，從而限制了其在厭氧體系中的應用。來源于枯草芽孢桿菌的基于黃素單核苷酸結合的藍色熒光蛋白質YtVA的發現為解決這一問題提供了新的途徑(Losi，A.；Polverini，E.；Quest，B.；Gartner，W.Biophys.J.2002，82，2627.)，該蛋白質在厭氧和好氧微生物中都能發出熒光(Drepper，T.；Eggert，T.；Circolone，F.；Heck，A.；Krauss，U.；Guterl，J.K.；Wendorff，M.；Losi，A.；Gartner，W.；Jaeger，K.E.Nat?Biotechnol?2007，25，443.)。YtvA由261個氨基酸組成，主要包括一個LOV(light，oxygen，voltage)亞基(殘基25-126)和一個STAS(sulfate?transporter/anti-σfactor?antagonist，148-258)亞基(殘基148-258)。在溶液中YtvA和LOV亞基都是以二聚體形式存在。其中包含LOV亞基的晶體結構(殘基21-147)已經被解析(Moglich，A.；Moffat，K.J.Mol.Biol.2007，373，112.)，表明黃素單核苷酸結合在該亞基上是蛋白質的生色團。Drepper等發現，把暗狀態下與黃素單核苷酸形成共價鍵的半胱氨酸C62突變成丙氨酸可以提高熒光量子產率(Drepper，T.；Eggert，T.；Circolone，F.；Heck，A.；Krauss，U.；Guterl，J.K.；Wendorff，M.；Losi，A.；Gartner，W.；Jaeger，K.E.Nat?Biotechnol?2007，25，443.)；與YtVA相似，來源于惡臭假單胞菌的藍色熒光蛋白質SB2的C53A突變體也提高了熒光亮度(Drepper，T.；Eggert，T.；Circolone，F.；Heck，A.；Krauss，U.；Guterl，J.K.；Wendorff，M.；Losi，A.；Gartner，W.；Jaeger，K.E.Nat?Biotechnol?2007，25，443.)。這些研究成果被包含在德國專利DE102005048828A1中。德國公司Evocatal?GmbH已經制造銷售這些蛋白質，其產品名為對于來源于枯草芽孢桿菌熒光蛋白質命名系列，來源于惡臭假單胞菌的熒光蛋白質命名為系列。為了提高熒光亮度或者移動熒光發射頻率，美國專利US20100304435A1對進行了突變改造，包括如下的一個或多個位點突變體：I29V，S91G，Y112F，E138G，L7P，F124L，N26Y，Y112H，I48T，H61Y，Y43F，Y112C，E12D，Q143L，A36T，Q57H，N95I，E22K，E71G，K88S，L109V，Q116L。與相比，其中4突變體E12D，H61Y，Y112F，Q143L有較好的熒光亮度增強(37％)，而5突變體E22K，E71G，K88S，L109V，Q116L則減小最強發射波長12納米。在以下的描述中，我們簡稱基于黃素單核苷酸結合的藍色熒光蛋白質為FbFP(flavin?mononucleotide?based?fluorescence?protein)。

FbFP可以在細胞內做熒光標記，用以研究基因表達調控，蛋白質定位，蛋白質相互作用，應用在生物傳感器領域等。監測基因表達可以通過把編碼熒光蛋白質的DNA與編碼感興趣基因的DNA相連，然后通過檢測熒光來實現。蛋白質定位則可以通過把熒光蛋白質與感興趣蛋白質相連，通過熒光檢測來確定蛋白質所在亞細胞室的位置。而蛋白質相互作用則可以通過對感興趣體系進行熒光蛋白質標記，然后使用熒光共振轉移方法來研究。相比于傳統的綠色熒光蛋白質，FbFP蛋白質還可以用來對厭氧微生物體系進行研究和高通量篩選。例如可以篩選用以抗癌治療的厭氧菌。