[發(fā)明專利]分離和擴增臍帶新鮮組織間充質(zhì)干細胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210159918.1
• 申請日: 2012-05-21
• 公開（公告）號: CN102660501A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳俊峯;林卓衡;朱業(yè)峰;周丹
• 申請（專利權(quán)）人: 博雅干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;G06F19/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.從臍帶新鮮組織中分離和擴增間充質(zhì)干細胞的方法，該方法包括以下步驟：

(1)消毒和清洗：用消毒液(例如酒精)對臍帶組織表面進行消毒，將臍帶剪開，平鋪，通過緩沖液(例如PBS緩沖液)清洗臍帶組織，以減少臍帶組織上紅細胞；

(2)消化處理：將步驟(1)得到的臍帶組織剪成組織塊，將組織塊放入消化酶溶液(例如其非限制性地包含I型膠原酶、DMEM-F12)中，消化處理0.5-3小時(例如1-2小時，例如1.5小時)，過濾清除組織塊后，加入間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基以終止消化，然后對消化得到的細胞進行細胞清洗，最終獲得細胞懸液；

(3)細胞培養(yǎng)：將步驟(2)得到的細胞懸液放入培養(yǎng)容器，再將培養(yǎng)容器放進培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)時將培養(yǎng)容器從培養(yǎng)箱中取出，補加適量(例如3ml)間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；在第8-11天(例如第9天)時將培養(yǎng)容器從培養(yǎng)箱中取出，進行第一次全換液，繼續(xù)培養(yǎng)；往后每1-3天(例如2天)進行一次全換液；

(4)細胞傳代：當培養(yǎng)容器中的貼壁細胞融合率達到40%-70%(例如60%)以后，利用消化酶(例如TrypLe?Express)將貼壁細胞脫離容器底部，離心，抽走上清液，加入充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞，再接種于培養(yǎng)容器進行傳代并進行擴增培養(yǎng)，此后每1-3天(例如每2天)換液一次，直至融合率達到70-90%(例如80%)后，即得臍帶間充質(zhì)干細胞，必要時進行傳代；

以及任選的下列一個或多個步驟：

(5)針對步驟(4)所得臍帶間充質(zhì)干細胞，檢測以下項目的至少一項：細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；

(6)將步驟(4)所得傳代后的臍帶間充質(zhì)干細胞于液氮中冷凍，備用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述臍帶是臍帶的新鮮離體組織。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(2)中，剪碎的組織是大小約0.2-2.5立方厘米。

4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(2)中，消化處理的時間為1-2.5小時。

5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中包含F(xiàn)BS、L-Glutamine、Gentamicin和DMEM-F12。

6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中：

所述間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中含有10-20%的FBS；

所述間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中含有0.5-2%的L-Glutamine；

所述間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中含有0.02-0.1%的Gentamicin；和/或

所述間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中含有80-90%的DMEM-F12。

7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中含有約15重量份的FBS、約1重量份的L-Glutamine、約0.05重量份的Gentamicin和約84重量份的DMEM-F12。