[發明專利]一種固定化酶及其制備方法

無效

• 申請號: 201210159796.6
• 申請日: 2012-05-22
• 公開（公告）號: CN103421762A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 黃雅欽;楊寅;李承明
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種固定化酶及其制備方法，尤其是穩定性得到改善的固定化酶及其制備方法。

背景技術

酶可以作為一種催化劑，酶促催化反應具有高效性、專一性、選擇性、反應條件溫以及無污染等特點。然而，由于酶本身是一種蛋白質，其在游離狀態時易受反應條件的影響而導致其失活。例如，在強酸、強堿、高離子濃度、高溫、低溫、或者有機溶劑的條件下，酶可能會發生變性，從而導致其失活。目前，酶作為催化劑時，由于其利用率低、成本高，因此大大限制了其在工業領域中的應用。

CA?2277371公開了一種酶固定化的方法：將具有表面羥基的硅土支持物與含多醛的第一水溶液保溫，隨后使含酶的第二水溶液與修飾后的載體接觸和最后從溶液中除去支持物。

EP?133531描述了一種酶固定化的方法：(a)引入包含酶和聚乙烯亞胺的水性介質和(b)將戊二醛和殼聚糖加入水性介質和隨后從液體介質中移出交聯產物。

US?4,888,285公開了一種酶固定化方法：通過在有機溶劑中與氨基硅烷衍生物反應而將硅膠改性，然后在戊二醛、丹寧酸和殼聚糖存在下將得到的胺化支持物與酶進行連接。

以上方法均容易造成酶的失活，酶的活力回收率較低。

選擇適宜的載體材料將酶進行固定化以得到固定化酶，從而可以實現對酶的快速分離和重復使用，并且通過控制固定化酶的微環境可以增強酶的穩定性。例如，申請號為02117614.0的中國專利申請公開了一種固定化脂肪酶催化合成脂肪酸低碳醇酯的方法，其中的步驟包括：固定化載體惰性載體膜或紡織物先用共固定劑活化，將固定化載體和共固定劑按質量體積比1∶1～1∶3的比例混合(W∶V)，室溫晾干，脂肪酶溶液按1000～30000單位/克載體的比例與活化后的固定化載體混合，晾干待用。但是，由于載體的吸附能力較低，且未進行包覆，上述固定化酶的穩定性仍不夠好。

目前，固定化酶（例如過氧化氫酶）的載體材料主要為包括有機材料和無機材料。有機材料包括殼聚糖、纖維素、改性生物材料等；無機材料包括氧化鋁、氫氧化鋁等。多孔材料由于具有均衡且可調節的孔徑、高比表面積和孔隙率以及通道結構等特點，被認為是固定化酶理想的載體材料。碳材料是具有代表性的多孔材料，其具有非常高的比表面積及孔隙率，因而具備較強的吸附能力；此外，該碳材料沒有毒性、機械強度好、價格低廉。因此，碳材料是固定化酶良好的吸附材料。例如文獻（Qi?Wang，et?al.Enzyme?and?Microbial?Technology，49(2011)，11–16）公開了一種固定化酶的方法，以碳納米管為載體吸附木瓜蛋白酶，采用仿生硅化法在碳納米管-木瓜蛋白酶生物軛合物表面包覆氧化硅薄層，從而得到固定化木瓜蛋白酶。其與游離酶及未經包覆的碳納米管-木瓜蛋白酶生物軛合物相比，在嚴格的pH、溫度環境中顯示出了更高的活性和穩定性。但是重復催化反應7次，其活力僅保持原始活力的70%，距離工業化應用還有一定的差距。因此，雖然碳材料對酶分子的吸附性較強，滿足了高吸附量的需求，但單純的物理吸附的方法仍然存在高泄漏率及固定化酶穩定性較差的瓶頸。

發明內容

為了克服現有技術的缺陷，本申請的發明人進行了反復的深入研究。

本發明的一個目的在于提供一種固定化酶的制備方法，其可以提高酶的活力回收率，并改善酶的熱穩定性。進一步地，本發明的制備方法還可以改善酶的操作穩定性。

本發明的另一個目的在于提供一種固定化酶，其熱穩定性得到改善。進一步地，本發明的固定化酶還可以改善酶的操作穩定性。

本申請的發明人令人驚奇地發現如下技術方案可以實現上述目的。

一種固定化酶的制備方法，其包括如下步驟：

（1）將具有吸附作用的碳材料與含有酶的液體介質接觸以進行吸附，從而得到吸附有酶的碳材料，即酶-碳材料；

（2）將該酶-碳材料與含明膠的液體介質接觸，以形成表面包覆明膠的酶-碳材料；

（3）通過交聯劑將表面包覆明膠的酶-碳材料中的明膠進行交聯，以得到明膠包覆碳材料固定化酶。

根據本發明所述固定化酶的制備方法，優選地，具體包括如下步驟：

（1）將具有吸附作用的碳材料置于含有酶的液體介質中以進行吸附，除去上清液，從而得到吸附有酶的碳材料，即酶-碳材料；

（2）將該酶-碳材料與含明膠的液體介質混合均勻以形成混合液，并制得表面包覆明膠的酶-碳材料；

（3）將上述混合液與交聯劑混合以進行交聯反應；

（4）任選地，將反應得到的混合物冷凍干燥。