[發(fā)明專利]一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210153561.6
• 申請日: 2012-05-15
• 公開（公告）號: CN102653560A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 莊惠生;陳寒玉
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C07K14/765;C07K1/113
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 林君如

1.一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，該方法首先通過半抗原合成免疫原，然后采用動(dòng)物免疫方法制備得到抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的通過半抗原合成免疫原具體包括以下步驟：

(1)稱取半抗原置于潔凈干燥的小錐形瓶中，加入DMF使其溶解，控制半抗原的濃度為0.1mmol/100μLDMF；

(2)按重量比為64-65∶38-39稱取DCC與NHS，并將其溶于DMF中，DCC的濃度為64-65mg/200-300μLDMF，在磁力攪拌下將制備得到的混合溶液逐滴加到小錐形瓶中，混合溶液與步驟(1)制備得到的半抗原溶液的體積比為2-3∶4，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h，4℃過夜；

(3)將步驟(2)制備得到的產(chǎn)物置于低溫高速離心機(jī)9000r/min，經(jīng)15min分離出上清液；

(4)稱取160mg?BSA溶于濃度為0.02mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，BSA在磷酸鹽緩沖溶液中的濃度為160mg/10mL，然后逐滴加入上清液，上清液加入量為磷酸鹽緩沖溶液的6v/v％，再于冰浴條件下反應(yīng)4h；

(5)反應(yīng)結(jié)束后，將得到的溶液裝入透析袋，自來水沖洗48h，0.9％生理鹽水透析3d，離心分出上清液，即得PCB-BSA，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)掃描鑒定后，分裝于5mL離心管中冷凍保存。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的半抗原為二氯聯(lián)苯半抗原、三氯聯(lián)苯半抗原及四氯聯(lián)苯半抗原，分子式分別為：熔點(diǎn)分別為154-156℃、162-164℃和272-274℃，三種半抗原制備得到的PCB-BSA分別為3，4-二氯聯(lián)苯-BSA、3，4，4’-三氯聯(lián)苯-BSA、3，3’，4，4’-四氯聯(lián)苯-BSA。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的動(dòng)物免疫方法包括以下步驟：用已純化的3，4-二氯聯(lián)苯-BSA、3，4，4’-三氯聯(lián)苯-BSA及3，3’，4，4’-四氯聯(lián)苯-BSA免疫原按照體積比為1∶1∶1的比例混合后，取完全佐劑充分乳化，然后對哺乳動(dòng)物或禽類進(jìn)行首次免疫注射，然后再以不完全佐劑進(jìn)行追加強(qiáng)化反應(yīng)，待60-100天后哺育動(dòng)物血清或禽類蛋黃中即含有抗多氯聯(lián)苯抗體，將血清或蛋黃收集，純化抗體，凍干保存即可。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的首次免疫注射采用等量的完全佐劑充分乳化，所用的免疫原的用量為0.4-1.0mg/只，優(yōu)選0.5-1.0mg/只。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物包括家兔、羊、馬、豚鼠、豬或猴，優(yōu)選兔或豚鼠，禽類包括雞、鴨、鵝或鶴鶉，優(yōu)選雞；上述動(dòng)物為適齡、健壯、無感染的動(dòng)物，優(yōu)選雄性動(dòng)物，動(dòng)物的年齡應(yīng)是青壯年，兔優(yōu)選月齡3個(gè)月，體重2-3kg的成年新西蘭雄性大白兔，雞優(yōu)選蛋雞。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，免疫注射的部位和方式包括靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射，這些方法可以單獨(dú)使用或多種組合使用，優(yōu)選背部皮下多點(diǎn)注射、皮內(nèi)多點(diǎn)注射、腿部肌肉注射單獨(dú)或多種組合使用。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，追加強(qiáng)化反應(yīng)時(shí)，第一次加強(qiáng)選擇首次免疫后2-4周，更優(yōu)選3周，以后的加強(qiáng)選擇2-4周，更優(yōu)選2-3周；所述的加強(qiáng)免疫反應(yīng)所用的免疫原的用量為首次免疫原用量的0.5-1.5倍，優(yōu)選等量。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，第二次加強(qiáng)免疫后2-3周，測定哺育動(dòng)物血清或禽類的蛋黃中抗體效價(jià)，待效價(jià)符合要求后進(jìn)行哺育動(dòng)物采血或收集禽類的抗體蛋，純化抗體，凍干保存。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，抗體效價(jià)的測定方法包括試管凝集試驗(yàn)、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、放射免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附分析或熒光免疫分析，優(yōu)選雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附分析或熒光免疫分析。