[發明專利]一種香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201210151982.5
• 申請日: 2012-05-17
• 公開（公告）號: CN102703605A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 黃俊生;彭軍;郭建榮;郭立佳;楊臘英;王國芬;梁昌聰
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其特征在于，其試劑包括：

由兩對引物構成的引物混合液，所述兩對引物為：外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:l所示，外引物2-CMV-B3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示，內引物1-CMV-FIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示，內引物2-CMV-BIP，其核苷酸序列如SEQID?NO:4所示，所述內引物1-CMV-FIP和所述內引物2-CMV-BIP的濃度均為40pmol/μl，所述外引物1-CMV-F3和所述外引物2-CMV-B3的濃度分別為5pmol/μl；

濃度為8U/μl的Bst?DNA聚合酶；

8U的反轉錄酶；

RNA提取液，所述RNA提取液包含：100mM?Tris-HCl(pH7.4)、1M?KC1、10mM?EDTA、和2%(w/v)PVPP；

反應緩沖液，所述反應緩沖液包含：10mM?dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、150mM?MgSO₄、5mM甜菜堿＝8:5:2:10；

核酸染料；

陽性對照：含有香蕉花葉心腐病毒外殼蛋白的cDNA；

陰性對照：100mM?Tris-HCl(pH?8.0)和50mM?EDTA。

2.根據權利要求1所述的香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其特征在于，所述核酸染料為1000×SYBR?Green?I。

3.一種香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒的使用方法，該方法包括下列步驟：

1)被檢樣品的RNA核酸提取：向0.5mg待檢測樣品中加入30μlRNA提取液，研磨成糊狀后，在95℃10min，10000rpm下離心2分鐘，取上清作為檢測模板RNA；

2)環介導等溫擴增反應：

在25μl?PCR管中配置反應溶液：1μl的外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:l所示；1μl的外引物2-CMV-B3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；1μl的內引物1-CMV-FIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示；1μl的內引物2-CMV-BIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示；12.5μl的反應緩沖液；8U的Bst?DNA聚合酶1μl；8U的反轉錄酶0.2μl、2μl的模板RNA；

然后加水至25μl；設置陽性對照反應時，用含有香蕉花葉心腐病毒外殼蛋白的cDNA代替1)中得到的檢測模板RNA，設置陰性對照反應時，用100mM?Tris-HCl(pH?8.0)和50mM?EDTA代替1)中得到的檢測模板RNA，將含有配制好的反應溶液的PCR管于63℃恒溫反應90min；

3)分析判斷反應產物結果：在2)中所得產物中加入1μl的核酸染料，如反應液顏色為橙色，表示結果為陰性，如反應液顏色為綠色，表示結果為陽性。

4.根據權利要求3所述的香蕉花葉心腐病毒恒溫基因擴增快速檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述核酸染料為1000×SYBRGreenI。