[發明專利]一種外周血單個核細胞的凍存液及凍存方法

無效

• 申請號: 201210149968.1
• 申請日: 2012-05-15
• 公開（公告）號: CN102669087A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 劉韜
• 申請（專利權）人: 深圳市博泰生物醫療機構管理有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地講，本發明涉及一種外周血單個核細胞的凍存液及凍存方法。

背景技術

外周血單個核細胞(peripheral?blood?mononuclear?cell,PBMC)，指外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞、單核細胞（monocyte）、樹突狀細胞和其它少量細胞（造血干細胞等）。PBMC是制備細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK）的種子細胞，CIK細胞因其同時表達CD3和CD56而被認為是新一代腫瘤過繼免疫治療的首選方案。在臨床應用過程中，常見的問題是很難保證提供足夠數量的PBMC。針對該問題目前常用的做法是，利用低溫凍存技術保存外周血單個核細胞，在需要時復蘇并誘導培養為各種免疫細胞。但凍存過程會顯著改變細胞的熱力學、化學和物理環境，同時伴隨生物性損傷的危險。

為了將凍存過程中細胞的損傷降至最低，使細胞復蘇時存活率最高，最佳的冷凍條件是盡可能地降低細胞內的晶體形成，減少細胞內水凝固所形成的高濃度溶質對細胞造成的低溫損傷。因此需要采取緩慢冷凍、加入冷凍保護劑排除水分、在盡可能低的溫度下保存細胞、快速復蘇等方法來達到對細胞產生最低損傷的目的，其中冷凍保護劑的作用十分重要。常用的冷凍保護劑主要有甘油、二甲基亞砜(DMSO)等滲透性試劑，以及羥乙基淀粉（HES）、白蛋白和聚乙二醇（PEG）等非滲透性試劑，目前常用的是DMSO。

現有技術中，細胞凍存復蘇后的存活率通常在70%-90%之間。日本學者Makino?S等采用5%DMSO、6%羥乙基淀粉、4%人血清白蛋白凍存自體外周血干細胞，凍存于-80℃，獲得的復蘇存活率為88.4%±3.6%，為目前已知報道中最高的存活率。不過葉韻斌等學者的報道顯示，用此方法凍存的細胞回輸給患者，有些患者出現了不適癥狀，原因可能是羥乙基淀粉（HES）為大分子物質，個別患者在使用含羥乙基淀粉的藥品時，可能發生過敏性反應。

因此，為提供足夠量的PBMC，現有技術中細胞凍存復蘇后的存活率仍需進一步提高，同時也應避免回輸給患者時出現惡心、嘔吐或過敏等不良反應。

發明內容

針對上述現有技術中的不足，本發明的目的是提高PBMC細胞凍存復蘇后的存活率，同時避免將復蘇后的PBMC細胞回輸給患者時出現不良反應。

為了實現上述發明目的，本發明技術方案如下：

一種外周血單個核細胞凍存液，包含10-12%(V/V)滲透性冷凍保護劑，10-14%(V/V)β-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血漿，64-72%(V/V)生理鹽水。

以及，一種外周血單個核細胞凍存方法，包括以下步驟：

（1）將外周血單個核細胞懸浮于細胞培養液中，獲得外周血單個核細胞懸液；

（2）將所述外周血單個核細胞懸液與本發明的外周血單個核細胞凍存液按照0.9-1.1∶1的比例混勻，分裝于細胞凍存管中；

（3）將所述細胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于-80℃冷凍，然后轉入液氮中凍存。

本發明的PBMC凍存液使用了經美國FDA認證安全的β-葡聚糖作為冷凍保護劑，使凍存復蘇后的PBMC的存活率達到91.56%左右，且使用本發明的PBMC凍存液的單個核細胞復蘇后經誘導培養得到的CIK細胞中CD3⁺CD56⁺T細胞的比例與未凍存的PBMC相比十分接近，且兩者的細胞生長曲線和增殖倍數沒有明顯差異，并且將該CIK細胞回輸給患者后未引起不適癥狀。

附圖說明

圖1為使用本發明實施例1的凍存液凍存PBMC復蘇后誘導得到CIK細胞與未凍存的PBMC誘導得到的CIK細胞的生長曲線圖；

圖2為使用本發明實施例1的凍存液凍存PBMC復蘇后誘導得到CIK細胞與未凍存的PBMC誘導得到的CIK細胞中CD3⁺CD56⁺T細胞的流式檢測圖，其中（a）為本發明實施例1的凍存液凍存的PBMC的檢測結果，（b）為未凍存的PBMC的檢測結果。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。