[發(fā)明專利]一種雜合抗菌肽畢赤酵母工程菌制備方法及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210149859.X
• 申請日: 2012-05-15
• 公開（公告）號: CN103205370A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李本濤;李帥偉
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州格拉姆生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/62;C12N15/81;C07K19/00;A23K1/17;C12R1/84
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說是一種雜合抗菌肽基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌制備方法及應(yīng)用。?

背景技術(shù)

抗菌肽(antibacterial?peptides)，又稱抗微生物肽(peptide?antibiotics)，是生物體在抵抗病原微生物的防御反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一種具有抗微生物小分子多肽，廣泛存在于植物、細(xì)菌、無脊椎動(dòng)物及脊椎動(dòng)物體內(nèi)，是生物先天免疫的重要效應(yīng)分子。自瑞典科學(xué)家Boman等人于1981年首次從古比天蠶(Hyalophora?cecropin)中發(fā)現(xiàn)抗菌肽——天蠶素(cecropin)A和B以來，目前已從昆蟲、甲殼類、鳥類、兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物體內(nèi)成功分離出幾百種抗菌肽。抗菌肽除了具有廣譜的抗菌活性外，還具有抗原蟲、抗真菌、抗病毒和抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞等作用。抗菌肽有著與青霉素等傳統(tǒng)抗生素完全不同的作用機(jī)制，病原菌不易產(chǎn)生對抗菌肽的耐藥性，此外，抗菌肽一般情況下只作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞，而對正常的真核細(xì)胞無影響。在畜牧業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)及飼料中長期添加抗生素的做法受到嚴(yán)格檢查和廣泛質(zhì)疑的背景之下，抗菌肽獨(dú)特的殺菌機(jī)制和理化性質(zhì)使其作為無毒無害無殘留的抗微生物添加劑在飼料中有著廣泛的應(yīng)用前景。?

作為一種廣譜、高效、無殘留的新型抗微生物藥物，抗菌肽應(yīng)用于飼料中具有明顯的優(yōu)勢：(1)動(dòng)物抗菌肽具有熱穩(wěn)定性，可耐受飼料制粒時(shí)的高溫而不導(dǎo)致動(dòng)物抗菌肽失活；(2)動(dòng)物抗菌肽具備抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的?能力，添加在飼料中可經(jīng)消化道完整吸收而發(fā)揮作用；(3)動(dòng)物抗菌肽殺菌機(jī)理獨(dú)特，病原菌不易對動(dòng)物抗菌肽產(chǎn)生耐藥性，并且無殘留；(4)通過基因工程方法生產(chǎn)抗菌肽，可大規(guī)模生產(chǎn)，周期短，成本低且不易受外在因素的影響。?

蜂毒肽是意大利蜂(Apismellifera)毒液的主要活性成分，由20個(gè)氨基酸組成，一級結(jié)構(gòu)為：GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2，蜂毒肽能夠形成兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)，5個(gè)堿性氨基酸中的4個(gè)集中在肽鏈的C端(KRKR)，是典型的陽離子抗菌肽。牛乳鐵蛋白肽Lfcin?B是所有牛乳鐵蛋白中活性最高的，抑菌效果是牛乳鐵蛋白400倍，能在胃腸道中發(fā)揮更重要的作用。根據(jù)抗菌肽牛乳鐵蛋白肽(Lfcin?B)與富含甘氨酸的蜂毒肽(Melittin)的核心功能序列，將Lfcin?B(1-25)和Magainin(12-26)二者連接起來，設(shè)計(jì)一種新型雜合抗菌肽LFB-Mel，該抗菌肽分子N端形成親水脂的兩個(gè)反向β折疊結(jié)構(gòu)，中間形成雙親性的α螺旋結(jié)構(gòu)，C端的連續(xù)四個(gè)堿性氨基酸使得抗菌肽分子帶有正電荷，能夠與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合，雜合抗菌肽摒棄了蜂毒肽的溶血活性，其抗菌活性和穩(wěn)定性均優(yōu)于單一抗菌肽分子。?

將該雜合抗菌肽基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌，進(jìn)行高密度發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)，制成抗菌肽產(chǎn)品，該產(chǎn)品經(jīng)豬養(yǎng)殖試驗(yàn)表明，能夠完全代替抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的使用，具有抗病、促進(jìn)生長、提高免疫力、降低料肉比和提高繁殖能力等功能，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種新的雜合抗菌肽LFB_Mel和編碼該蛋白的基因Lfcin?B_Mel。?

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該抗菌肽制品的生產(chǎn)方法。?

本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供該抗菌肽在飼料添加劑中的應(yīng)用。?

抗菌肽作為飼料添加劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中有其獨(dú)特的優(yōu)勢，抗菌肽能耐受飼料制粒時(shí)的高溫，規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽時(shí)經(jīng)高溫濃縮工序，可充分殺滅酵母菌體而不導(dǎo)致抗菌肽失活，產(chǎn)品在推廣應(yīng)用后不會(huì)出現(xiàn)工程菌的擴(kuò)散而導(dǎo)致環(huán)境生態(tài)問題。以基因工程方法制備工程菌，并用工程菌產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽，其生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低，且不受季節(jié)和氣候變化等外在環(huán)境的影響，可大規(guī)模生產(chǎn)。?

抗菌肽產(chǎn)品具廣譜抗菌作用，對畜禽具有促生長、保健和治療疾病的功能，是很好的抗生素替代品，能有效地解決人和動(dòng)物藥殘和病原菌耐藥性的問題，屬無毒副作用、無殘留、無耐藥性的一類環(huán)保型綠色飼料添加劑。?

附圖說明

圖1是分段引物PCR互補(bǔ)合成雜合抗菌肽基因Lfcin?B_Mel流程圖。?

圖2是電泳檢測PCR互補(bǔ)合成的雜合抗菌肽基因圖。?

圖3是質(zhì)粒載體pPICZaA物理圖譜。?

圖4是雜合抗菌肽基因畢赤酵母重組菌株構(gòu)建的流程圖。?

圖5是SDS-PAGE檢測雜合抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)，1為Protein?Marker，2為空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌后誘導(dǎo)表達(dá)的對照，3為雜合抗菌肽畢赤酵母工程菌誘導(dǎo)表達(dá)檢測。?