[發明專利]一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法

有效

• 申請號: 201210148345.2
• 申請日: 2012-05-15
• 公開（公告）號: CN102660525A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 苗丕渠;蘇古方;池正昌
• 申請（專利權）人: 揚州艾迪生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 謝東

技術領域

本發明涉及一種尿蛋白提取方法，尤其涉及一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法。

背景技術

人尿中含有三百多種蛋白質，目前已開發提取的主要有尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制劑和人尿激肽原酶等，這些組分在臨床上具有重要的治療價值。

人尿激肽原酶（Urinary?Kallidinogenase，以下簡稱為KN），是從人尿中分離提取的一種由238個氨基酸組成的糖蛋白，等電點在4左右，分子量約54000D，屬于絲氨酸蛋白酶。它能夠激活人血漿激肽原轉化為激肽。目前，已經被開發成用于治療急性腦梗死的藥物。

人尿胰蛋白酶抑制劑（Urinary?trypsin?inhibitor，以下簡稱為UTI）是一種從人尿中分離純化的由143個氨基酸組成的糖蛋白，等電點在2左右，分子量65000D，具有抑制多種蛋白酶、糖酶和脂酶等水解酶的活性；從而抑制炎癥介質的過度釋放；改善微循環和組織灌注。而在機體受到嚴重損傷時起抑制全身性炎癥反應（SIRS）的發生發展、繼而阻斷多臟器功能障礙（MODS），保護臟器功能等作用。

尿蛋白產品目前主要的生產過程是：首先，在各地經過尿蛋白的吸附、洗脫、沉淀等步驟制備尿蛋白粗制品；其次，尿蛋白粗制品經過下游的分離純化和精制，制備尿蛋白原料藥；最后灌裝成品制劑，用于臨床。

中國人尿資源非常豐富，依賴于這一有利條件，尿蛋白產業從上世紀七十年代末就已經開始發展起來，至今已有三十多年。在尿蛋白粗制品的規模化生產方式主要有兩種，方法一：收集尿液，運輸到加工點，用吸附劑吸附尿蛋白，由于尿液來源分散，收集成本高，加上城市衛生改造，收集已經越來越困難；方法二：直接將吸附尿蛋白的樹脂放置在廁所進行連續在線吸附，然后收集吸附后的樹脂運回加工點進行分離純化。這種方法對環境無污染，可以在大中城市進行收集，尿源集中，運輸成本較低，極大地擴大了尿蛋白的收集區域。

目前，KN粗品主要按照第一種方法制備，需要首先收集尿液，再用吸附KN的吸附劑單獨對尿液進行吸附處理。尿液中的KN含量低、不穩定、容易降解，導致生產的收率很低、成本很高，后續純化難度大。

在采用第二種方法制備KN粗品時，采用高效陰離子吸附劑，放置尿斗或尿池中，其可以在人尿流經吸附劑的同時，把其中KN和UTI等蛋白有效吸附，從而實現這些尿蛋白的高度富集，再經過集中洗脫、沉淀等步驟得到粗品。該方法中，KN迅速被固定化，大大提高了其穩定性，由于避免了尿液的大規模運輸，也明顯降低了成本。但是，該方法中，由于吸附劑較強的吸附性能，同時吸附了較多蛋白，給下游的純化帶來較大的難度。尤其是KN和UTI，二者分子大小相近，且均為酸性蛋白，常規的純化方法對其較難分離，影響了KN的后續純化。

發明內容

發明目的：本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種高效分離出尿液中的KN和UTI，便于KN和UTI后續純化的制備人尿激肽原酶粗制品的方法。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案為：

一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法：吸附劑吸附尿液中的尿蛋白一定時間后，收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液通過金屬螯合親和層析柱，其中的人尿胰蛋白酶抑制劑不吸附，而人尿激肽原酶則結合到該金屬螯合親和層析柱上，從而實現二者的分離，收集洗脫峰，制備人尿激肽原酶粗制品。

所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，包含以下步驟：

1)將陰離子交換樹脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池和尿斗中，吸附流經尿液或稀釋尿液中的尿蛋白；

2)收集已吸附尿蛋白的樹脂，進行清洗、解吸處理；

3)用0.5－1.0M的NaCl溶液進行洗脫，收集洗脫峰；

4)超濾濃縮；

5)超濾濃縮液調節pH和電導，上樣已經用平衡液平衡好的金屬螯合親和層析柱，再用平衡液沖洗；

6)繼續用洗脫溶液洗脫，收集洗脫峰；

7)在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2－10小時后，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品。可采用離心或者板框過濾收集沉淀。

步驟5的金屬螯合親和層析柱，其螯合的金屬離子可以是Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺中的任意一種。優選Cu²⁺。

步驟5中，金屬螯合親和層析柱平衡液為0.01－0.2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0－2M。優選0.02M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.2M。