[發明專利]含重組蛋白混合物的牛結核病檢測試劑

有效

• 申請號: 201210147678.3
• 申請日: 2012-05-11
• 公開（公告）號: CN102707052A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 朱鴻飛;賈紅;鑫婷;侯紹華;袁維峰;郭曉宇
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

1.一種用于牛分枝桿菌感染檢測的試劑，該試劑包括三種重組表達的牛分枝桿菌蛋白的混合物，其中所述的三種重組表達的牛分枝桿菌蛋白為CFP-10、ESAT-6和TB10.4。

2.權利要求1所述的用于牛分枝桿菌感染檢測的試劑，其中所述三種重組表達的牛分枝桿菌蛋白的混合比例為1~2∶1~2∶1~2。

3.權利要求2所述的用于牛分枝桿菌感染檢測的試劑，其中所述三種重組表達的牛分枝桿菌蛋白的混合比例為1∶1∶1或2∶2∶1或1∶1∶2。

4.權利要求1至3中任一項所述的用于牛分枝桿菌感染檢測的試劑，其中所述三種重組表達的牛分枝桿菌蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10.4編碼基因的核苷酸序列分別為SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3。

5.用于制備牛分枝桿菌感染檢測試劑的引物，其中包括3對引物，其中第一引物對的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:5，第二引物對的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:6和SEQ?ID?NO:7，第一引物對的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:8和SEQ?ID?NO:9。

6.權利要求5所述的引物在制備牛分枝桿菌感染檢測或診斷試劑中的用途。

7.一種制備牛分枝桿菌感染檢測試劑的方法，該方法包括：

（a）用權利要求5所述的引物PCR擴增獲得3種編碼基因；

（b）重組表達步驟（a）獲得的編碼基因得到3種重組蛋白；

（c）將步驟（b）獲得的3種蛋白按比例混合得到牛分枝桿菌感染檢測試劑。

8.權利要求7所述的制備牛分枝桿菌感染檢測試劑的方法，其中步驟（a）中的3種編碼基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3。

9.權利要求7或8所述的制備牛分枝桿菌感染檢測試劑的方法，其中步驟（b）中的重組表達的具體操作為：將含SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2或SEQ?ID?NO:3的重組質粒PET分別轉化至E.coli?BL21(DE3)感受態細胞中，挑取單菌落接種至10mL含終濃度25μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37℃?200r/min震蕩培養過夜，將1ml培養物接種于100ml含終濃度25μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37℃?200r/min震蕩培養至OD₆₀₀?nm=0.6時，加入終濃度為1mM的IPTG，22℃，160rpm震蕩培養10h。6000r/min離心10min收集菌體，用40mL?PBS（pH7.4）洗滌兩次，10ml?PBS（pH7.4）重懸后，冰浴超聲破碎菌體，破碎后混合物經12000rpm，4℃離心30min后取上清，蛋白上清液經濾膜過濾，用金屬鎳親和層析柱純化，并用脫鹽層析柱進行脫鹽，將重組蛋白置換到PBS（pH7.4）緩沖溶液中。

10.一種用于檢測牛分支桿菌感染的方法，該方法包括（a）剃毛后測量牛頸部上1/3處皮膚厚度；（b）向測量部位施用權利要求1至4任一項所述的診斷試劑；（b）72小時后，再測皮膚厚度，并計算該部位注射前后的皮厚差；當皮厚差大于等于2毫米時，判定為牛結核陽性，反之則為陰性。