[發明專利]一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法

有效

• 申請號: 201210145537.8
• 申請日: 2012-05-10
• 公開（公告）號: CN102643801A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 葉建仁;李浩;任嘉紅;付涵予;吳小芹
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/11;C12R1/01
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明涉及DNA提取方法。具體涉及一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法。

背景技術

在分子生物學技術的研究中，關鍵在于DNA的提取。常規的分子生物學操作如PCR、酶切、雜交對DNA的質量要求不高，一般分子生物學實驗指導書上的常規方法如濃鹽法、酚氯仿抽提法等即可滿足其要求。

隨著全基因組隨機測序方法—霹彈法（shotgun）的成熟，計算機拼裝算法的發展，近年來細菌基因組測序以每年50%的速度增長。新一代高通量基因組測序儀的迅速發展（Solexa，454GS-FLX，SOLID，tSMS）給基因組領域帶來革命性的突破。目前，細菌基因組研究進展迅猛，已有684個真細菌基因組和51個古細菌基因組序列發布。而且，對于細菌全基因序列的測定是分析細菌生物合成過程、基因調控、蛋白表達等之前非常必要的工作。通過全基因組測序，可以預測所含有的編碼序列、可能表達的蛋白、與各種細胞功能相關的基因，還可以預測未知功能的基因等，從而可開創性的研究預測一些可能的方向，使得生物學實驗具有可驗證性和可循證性。但全基因組測序對DNA的樣品具有高純度、大片段的要求，不同于一般PCR樣品的要求。

對于全基因組測序的基因組文庫構建，DNA的需求量較大，長度至少大于23kb，而且質量要求較高，應盡量避免多糖、蛋白質的殘留，否則影響庫的構建及后續測序工作。因此，一次性獲取高質高量的DNA就相當必要。

某些細菌在細胞壁外被一層厚度不定的透明膠狀物質所包被，這層物質統稱為糖被。它通常由多糖類、多肽類或多糖與多糖蛋白復合體組成。糖被具粘稠的特性，在進行DNA提取時，會與DNA結合形成共沉淀，獲得的DNA溶液常常黏度大乃至呈膠狀，在很大程度上影響基因組DNA提取的質量和數量。所以，如何高效簡便地去除細菌的多糖類物質，對提取純化細菌基因組DNA來說至關重要。

本實驗室于2010年6月在華大基因科技股份有限公司啟動了一株產多糖細菌的全基因組測序項目，但在提取該菌株全基因組DAN樣品時發現，常規提取方法無法達到完全去除多糖類物質的目的，不能滿足測序建庫要求。而且多糖類物質對核酸限制性內切酶和PCR都有抑制作用。因此，本發明提供了一種適合于產糖被細菌的DNA提取體系，可獲得高純度基因組DNA，而且DNA含量高，片段在23kb以上，完全滿足全基因組測序文庫構建及一般分子生物學實驗操作的要求。采用該方法提取的細菌DNA經華大基因科技股份有限公司檢測，檢測結論為合格，達到1類樣品標準，可以用于全基因組測序文庫構建。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種操作安全、簡便、高通量、成本低的一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，該方法包括以下步驟：

（1）向3~6mL產糖被細菌的培養物中加入400μL?DNA提取緩沖液和10μL溶菌酶的水溶液，37℃下靜置10min，再加入10μL蛋白酶K的水溶液，65℃下靜置1h；

（2）向步驟（1）得到的混合溶液中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，抽提，離心，取上清；

（3）向步驟（2）得到的上清中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合溶液，抽提，離心，取上清；

（4）向步驟（3）得到的上清液中，加入2倍體積的冷乙醇和0.1倍體積的醋酸鈉的水溶液，離心，沉淀經體積百分濃度為70%的乙醇洗滌后室溫干燥，加DNA提取緩沖液溶解；

（5）向步驟（4）得到的體系中加入RNA酶的水溶液10μL，37℃下靜置10min；

（6）向步驟（5）得到的體系中加入PEG6000，混勻，50℃下靜置10min；

（7）向步驟（6）得到的體系中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，抽提，離心，取上清；

（8）向步驟（7）得到的上清中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合溶液，抽提，離心，取上清；

（9）向步驟（8）得到的上清中，加入2倍體積的冷乙醇和0.1倍體積的醋酸鈉的水溶液，離心，沉淀經體積百分濃度為70%的乙醇洗滌后室溫干燥，加200μl?ddH₂O或者TE緩沖液溶解，即為提取到的DNA溶液，-20℃保存備用。