[發(fā)明專利]一種誘變?nèi)樗岙a(chǎn)生菌生產(chǎn)L-丙氨酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210142735.9
• 申請日: 2012-05-10
• 公開（公告）號: CN102719502A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃建坡;苗位云;孟凡會(huì);劉煥書;朱傳厚;韓秀麗;郭志遠(yuǎn);徐龍
• 申請（專利權(quán)）人: 淮北新旗氨基酸有限公司
• 主分類號: C12P13/06
• 分類號: C12P13/06;C12N15/01;C12R1/225
• 代理公司: 徐州支點(diǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32244
• 代理人: 劉新合

1.一種誘變?nèi)樗岙a(chǎn)生菌生產(chǎn)L-丙氨酸的方法，其特征在于，以乳酸產(chǎn)生菌德氏乳桿菌保加利亞亞種Lactobacillus?delbrueckii?subsp.?bulgaricus為出發(fā)菌種，活化出發(fā)菌→低能離子注入法誘變處理細(xì)胞→可逆抑制測定法篩選生產(chǎn)L-丙氨酸的突變株→擴(kuò)增培養(yǎng)種子液→厭氧發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸→發(fā)酵液凈化處理→制得成品，包括如下具體步驟：

A、活化出發(fā)菌：將出發(fā)菌德氏乳桿菌保加利亞亞種在斜面培養(yǎng)基上42℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.85%的生理鹽水制成菌懸液，稀釋至1mL菌懸液含菌數(shù)約為10⁷，鏡檢菌種健壯且無雜菌后，吸取0.1mL菌懸液均勻涂布于無菌空白培養(yǎng)皿上，無菌風(fēng)吹干制成菌膜；

B、低能離子注入誘變法誘變處理細(xì)胞：鏡檢無細(xì)胞重疊后，真空條件下對菌體細(xì)胞進(jìn)行離子注入處理，注入離子為N離子，劑量為1.5×10¹⁴-5×10^16?ions/cm²，能量為15-20keV，脈沖注入，每次注入5s，間隔時(shí)間15-40s；將經(jīng)過離子注入處理后的菌膜用1mL無菌生理鹽水進(jìn)行洗脫，然后取0.1mL洗脫液涂布于固體平板上，置于37?℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

C、可逆抑制測定法篩選生產(chǎn)L-丙氨酸的突變株：挑選離子注入后的單菌落進(jìn)行編號，并接種到對應(yīng)編號的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵液pH值在6.5-7.5，37?℃厭氧發(fā)酵48h；將發(fā)酵液過濾除去菌體，濾液經(jīng)121℃蒸汽滅菌20min，加入1.5%瓊脂，115℃蒸汽滅菌20min后，加入0.01-0.05%抑制劑，倒平板，并涂布指示菌，置于35-40℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；選取指示菌生長的平板所對應(yīng)的編號的突變菌株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過穩(wěn)定性試驗(yàn)，最終得到兩株編號為Lds.0108和Lds.1109的L-丙氨酸高產(chǎn)菌株；

D、擴(kuò)增培養(yǎng)種子液：Lds.0108和Lds.1109分別通過斜面培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，斜面培養(yǎng)時(shí)間24h，種子罐培養(yǎng)時(shí)間18h；

E、厭氧發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸：將擴(kuò)增后的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，底物葡萄糖濃度為6-12%，發(fā)酵溫度為35-40℃，培養(yǎng)基pH值為6.5-7.5，維持厭氧環(huán)境，待殘?zhí)菨舛刃∮?.1%則發(fā)酵完成，發(fā)酵時(shí)間30-52h；

F、發(fā)酵液凈化處理：先采用陶瓷超濾膜或有機(jī)管式超濾膜過濾，然后通過納濾膜進(jìn)一步過濾；

G、制得成品：納濾液經(jīng)過真空濃縮蒸發(fā)，結(jié)晶析出L-丙氨酸，經(jīng)離心，干燥得成品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘變?nèi)樗岙a(chǎn)生菌生產(chǎn)L-丙氨酸的方法，其特征在于，所述的可逆抑制測定法以L-氨基乙基磺酸為抑制劑，以普通變形桿菌Proteus?vulgaris為指示菌。

3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘變?nèi)樗岙a(chǎn)生菌生產(chǎn)L-丙氨酸的方法，其特征在于，所述的厭氧發(fā)酵過程中流加氨水或者液氨。

4.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘變?nèi)樗岙a(chǎn)生菌生產(chǎn)L-丙氨酸的方法，其特征在于，所述的陶瓷超濾膜或有機(jī)管式超濾膜采用20-50納米孔徑以下的。

5.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘變?nèi)樗岙a(chǎn)生菌生產(chǎn)L-丙氨酸的方法，其特征在于，所述的納濾膜采用600-1000分子量孔徑以下的。