[發(fā)明專利]一種檢測泰樂菌素和替米考星的試紙條及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210141503.1
• 申請日: 2012-05-08
• 公開（公告）號: CN103389379A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 萬宇平;吳鵬;羅曉琴;孫震;田甜;崔彥虎;徐念琴;余厚美;付軍權(quán)
• 申請（專利權(quán)）人: 北京勤邦生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測泰樂菌素和替米考星的試紙條及方法，具體涉及一種用于檢測泰樂菌素和替米考星的膠體金試紙條，其特別適于牛奶中泰樂菌素、替米考星殘留的檢測。

技術(shù)背景

泰樂菌素和替米考星屬于十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，廣泛地用作獸藥或飼料添加劑，預(yù)防和治療牛、羊、豬、雞等動物的感染性疾病，還被加入到飼料中用作生長促進劑。但該類藥物隨動物性食品進入人體后不僅會產(chǎn)生直接的毒性，還會發(fā)生過敏反應(yīng)及產(chǎn)生耐藥細菌。為保護食品安全和人類生命健康，很多國家都對該類藥物設(shè)置了較低的最高殘留限量，如歐盟在1999年禁止將泰樂菌素用作飼料添加劑，我國農(nóng)業(yè)部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定牛奶中泰樂菌素和替米考星的最高殘留限量為50μg/L。因此迫切需要研究一些高靈敏度、快速的方法對該類藥物殘留進行檢測監(jiān)控。

目前，檢測泰樂菌素和替米考星殘留的方法主要有微生物法、儀器分析法和免疫化學(xué)分析法等。微生物法檢測耗時長，缺乏特異性，且所用細菌對不同種類的抗菌藥物敏感性存在差異，易導(dǎo)致假陰性和假陽性產(chǎn)生；儀器分析法雖然具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、假陽性少等優(yōu)點，但樣品前處理過程復(fù)雜，儀器化程度高且價格昂貴，分析速度慢，僅適用于樣品的確證分析，不適合大批量樣品的篩選及現(xiàn)場檢測。與之相比，免疫學(xué)測定方法靈敏度較高、特異性強、試樣預(yù)處理簡單、分析時間短，適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測泰樂菌素和替米考星的試紙條。

本發(fā)明所提供的試紙條包括微孔試劑和試紙，微孔試劑具有微孔塞，試紙包括底板、樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護膜，其依次連接；所述微孔試劑中凍干有泰樂菌素特異性抗體-膠體金標(biāo)記物；泰樂菌素特異性抗體可為泰樂菌素單克隆抗體或泰樂菌素多克隆抗體；反應(yīng)膜上包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；當(dāng)泰樂菌素特異性抗體為泰樂菌素單克隆抗體時，檢測區(qū)包被替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被羊抗鼠抗抗體；當(dāng)泰樂菌素特異性抗體為泰樂菌素多克隆抗體時，檢測區(qū)包被替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被羊抗兔抗抗體。

所述替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物是由替米考星與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。

所述泰樂菌素特異性抗體-膠體金標(biāo)記物中的泰樂菌素特異性抗體是以泰樂菌素-載體蛋白作為免疫原制備獲得。

所述樣品吸收墊上粘貼有保護膜，為檢測端，上面有MAX標(biāo)記線。

所述檢測區(qū)位于近于有MAX標(biāo)記的保護膜的一端，所述質(zhì)控區(qū)位于遠離有MAX標(biāo)記的保護膜的一端。

所述底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；所述樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；所述吸水墊為吸水紙；所述反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；所述保護膜為PE材質(zhì)保護膜。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述試紙條的方法，其包括步驟：

1）制備凍干有泰樂菌素特異性抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑；

2）制備具有包被替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；

3）將2）制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護膜、底板組裝成試紙；

4）將1）和3）制備好的凍干有泰樂菌素特異性抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試紙條。

具體地說，步驟包括：

1）將泰樂菌素與載體蛋白偶聯(lián)，制備泰樂菌素-載體蛋白偶聯(lián)物；將替米考星與載體蛋白偶聯(lián)，制備替米考星-載體蛋白偶聯(lián)物；

2）用泰樂菌素-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞通過融合、篩選，得到分泌泰樂菌素單克隆抗體的雜交瘤細胞株或用泰樂菌素-載體蛋白免疫兔，得到泰樂菌素多克隆抗體；

3）提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；

4）分別將替米考星-載體蛋白和抗抗體包被于反應(yīng)膜的檢測區(qū)（T）和質(zhì)控區(qū)（C）；

5）用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；

6）將制備的泰樂菌素特異性抗體加入到制備的膠體金中，得到泰樂菌素特異性抗體-膠體金標(biāo)記物；

7）將泰樂菌素特異性抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑中后，將微孔試劑加上微孔塞；

8）將樣品吸收墊用含0.5%牛血清白蛋白（體積百分含量）、pH為7.2、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37℃下烘干2h；

9）在底板上按順序粘貼上樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護膜；