[發明專利]紅色熒光蛋白酵母細胞表達載體及構建方法

無效

• 申請號: 201210140915.3
• 申請日: 2012-05-07
• 公開（公告）號: CN102634538A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 李湘鳴;謝陽酶;李姍姍
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于基因生物工程領域，具體涉及一種紅色熒蛋白酵母細胞表達載體及構建方法。

背景技術

酵母是最常用的基因生物工程宿主細胞，這是酵母是單細胞低等真核生物細胞，不僅具有易培養、繁殖、生長條件要求不高等特點外，而且具有遺傳背景清楚、基因結構、基因調控、代謝和蛋白質翻譯后加工與哺乳動物細胞相似等特點。所以，用酵母細胞是常用生物工程細胞。

在研究酵母細胞的生物代謝特點及外源性基因的表達過程中，最常用是用酵母綠色熒光蛋白（yEGFP）作為的檢測信號，以觀察酵母細胞生物代謝過程以及外源性基因是否在酵母細胞中是否表達。但是，細胞生物代謝相當復雜，外源性基因種類又很多，如果要研究兩種或兩種以上代謝物之間的關系，僅用一種檢測信號難易實現，故需要有另外一種檢測信號來彌補其不足。

發明內容

為了方便研究酵母細胞生物代謝研究，本發明提供了一種紅色熒蛋白酵母細胞表達載體，可以有助于研究在酵母細胞的生物代謝和外源性基因的表達問題。

本發明采用的技術方案是：

一種紅色熒蛋白酵母細胞表達載體，是將SEQ?ID?No.1所示序列經BamH?I和Sal?I雙酶切后與pUC57載體相連得pUC57/yDsRed；將酵母強啟動子GPD插入到pYestrp2載體中得到pGPD；然后再用BamH?I和Not?I對pUC57/yDsRed酶切，常規回收yDsRed目的片段，將目的片段插入到pGPD的相應酶切位點而獲得；該載體命名為pGPD/yDsRed；結構如圖1。

上述所說的酵母表達載體的構建方法，包括下列步驟：

1）合成如SEQ?ID?No.1所示的yDsRed序列，該序列中包括兩端的各3個保護堿基，以及5′端的BamH?I和3′端的Sal?I和Not?I酶切位點，

2）將合成的上述yDsRed序列用BamH?I和Sal?I酶切，通過T4連接酶與pUC57相連，將其命名pUC57/yDsRed。

3）以Invitrogen公司的pYestrp2載體為基本框架，通過PCR方法從酵母基因組擴增酵母強啟動子GPD，并經Swa?I和BamH?I雙酶切，將其插入到pYestrp2載體中，構建成GPD驅動的酵母表達載體，命名為pGPD；

4)用BamH?I和Not?I對pUC57/yDsRed酶切，常規回收yDsRed目的片段，將其插入到pGPD的相應酶切位點，構建成紅色熒光蛋白酵母表達載體pGPD/yDsRed。

本發明所述表達載體pGPD/yDsRed是一種含有酵母嗜好密碼子的紅色熒光蛋白（yDsRed）報告載體，該載體轉入酵母細胞后，在酵母啟動子的驅動下紅色熒光蛋白可在酵母細胞中有效表達。因而可作為研究酵母生物學特點和酵母生物工程的理想工具。

附圖說明

圖1本發明構建成紅色熒光蛋白酵母表達載體pGPD/yDsRed結構示意圖。

圖2yDsRed在W303－1A中的表達。

具體實施方式

文中所用到的質粒：

pUC57：購自美國GenScript公司。

pYestrp2：購自美國Invitrogen公司。

1、參考pDsRed1-N1（Clontech公司產）的DsRed1基因序列，根據酵母嗜好的密碼子，在保證氨基酸序列不變的情況下，根據重疊延伸PCR設計方案，設計PCR引物，進行酵母密碼子優化。將PCR引物拆分為18條單鏈寡核苷酸（如下所示），由人工合成，重疊區平均堿基數為19bp，并在第一條引物的5′端增加BamH?I和3個保護堿基和第十八條引物5′端增加Sal?I、Not?I酶切位點和3個保護堿基（酶切位點為方框部分），利用重疊延伸PCR方法，人工合成含有全部酵母嗜好密碼子的紅色熒光蛋白（yDsRed）基因，在其的兩端分別含有3個保護堿基、BamHI、Sal?I和Not?I酶切位點，全長序列704bp（SEQ?ID?No.1）。PCR擴增選用pfu高溫聚合酶。PCR反應條件為：95℃預變性3min;94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，35循環，循環結束后，72℃再延伸10min，然后進入4℃。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化。

引物1（SEQ?ID?No.2）：

5′-ACTATGGCTTCTTCTGAAAATGTTATTACTGAATTCATGAGATTTAAAGTCAG-3′

引物2（SEQ?ID?No.3）：