[發(fā)明專利]人造DNA復(fù)制調(diào)控開關(guān)及其制備方法和檢測抗體的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210134412.5
• 申請日: 2012-05-03
• 公開（公告）號: CN103383396A
• 公開（公告）日: 2013-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏東元
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州博泰安生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 昆山四方專利事務(wù)所 32212
• 代理人: 盛建德

1.一種人造DNA復(fù)制調(diào)控開關(guān)，其特征在于：包括抗原-MBD融合蛋白、含至少一個甲基化mCpG位點的甲基化DNA模板和DNA多聚酶；或包括抗原-甲基化DNA模板和DNA多聚酶；

所述抗原-MBD融合蛋白由抗原與含有MBD的甲基化DNA?mCpG結(jié)合蛋白相融合制得，所述抗原能夠與被檢測抗體進行特異性結(jié)合并能夠抑制甲基化DNA?mCpG結(jié)合蛋白的MBD和所述甲基化DNA模板中的甲基化DNA?mCpG位點結(jié)合，恢復(fù)DNA多聚酶的活性；所述MBD能夠與所述甲基化DNA模板中的甲基化mCpG位點進行特異性結(jié)合且能夠抑制DNA多聚酶的活性；且所述兩種特異性結(jié)合在同一時間僅能進行擇一反應(yīng)；

所述抗原-甲基化DNA模板由抗原與含至少一個甲基化mCpG位點的甲基化DNA模板相融合制得，所述抗原能夠與被檢測抗體進行特異性結(jié)合并能夠抑制DNA多聚酶的活性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人造DNA復(fù)制調(diào)控開關(guān)，其特征在于：所述含甲基化mCpG位點的甲基化DNA模板由一條單鏈DNA模板和一條DNA多聚酶的單鏈DNA引物組成，所述至少一個甲基化mCpG位點位于所述DNA多聚酶的單鏈DNA引物和所述單鏈DNA模板上。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人造DNA復(fù)制調(diào)控開關(guān)，其特征在于：所述單鏈DNA模板的長度為70～100個堿基，所述DNA多聚酶的單鏈DNA引物的長度為10～30個堿基。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人造DNA復(fù)制調(diào)控開關(guān)，其特征在于：所述抗原為小分子類抗原、大分子類抗原或多肽類抗原，所述抗原-MBD融合蛋白中優(yōu)選大分子類抗原或多肽類抗原，所述抗原-甲基化DNA模板中優(yōu)選小分子類抗原。

5.根據(jù)權(quán)利要求1～4所述的人造DNA復(fù)制調(diào)控開關(guān)的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)抗原-MBD融合蛋白的制備：針對待測抗體，通過PCR法、DNA互補交換法和DNA連接酶法中的至少一種，將與待測抗體對應(yīng)的抗原和甲基化DNA?mCpG結(jié)合蛋白融合，得到抗原-MBD融合蛋白；

(2)含甲基化mCpG位點的甲基化DNA模板的制備：針對甲基化DNA?mCpG結(jié)合蛋白中MBD的結(jié)合特性選擇單鏈DNA模板與單鏈DNA引物，所述單鏈DNA引物能夠與所述單鏈DNA模板的3’端序列互補；將所選單鏈DNA模板的雙鏈結(jié)構(gòu)與所述單鏈DNA引物的雙鏈結(jié)構(gòu)混合均勻并加熱至解離溫度使之均解離為單鏈，然后冷卻至室溫使所述引物與DNA的解離單鏈互補序列配對結(jié)合，形成含有CpG位點的DNA模板；然后通過SssmI酶甲基化反應(yīng)將含有CpG位點的DNA模板混合物甲基化，得到含甲基化mCpG位點的甲基化DNA模板；

(3)抗原-甲基化DNA模板的制備：針對待測抗體，通過交聯(lián)反應(yīng)將抗原與(2)中所得含甲基化mCpG位點的甲基化DNA模板結(jié)合在一起，得到抗原-甲基化DNA模板；

(4)選擇DNA多聚酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人造DNA復(fù)制調(diào)控開關(guān)及其制備方法，其特征在于：所述人造DNA復(fù)制調(diào)控開關(guān)能夠根據(jù)被測抗體制備成定量測定相應(yīng)抗體的均相反應(yīng)試劑盒。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人造DNA復(fù)制調(diào)控開關(guān)用于檢測抗體的應(yīng)用，其特征在于：

(1)將抗原-MBD、DNA多聚酶緩沖液、dNTP混合物和0.5倍的SYBR熒光染料混合均勻后，向其中加入抗體樣品于室溫下保持10～15min，然后加入DNA多聚酶進行反應(yīng)，則體系中合成得到新DNA；所述新合成的DNA能夠與SYBR染料結(jié)合并釋放出熒光，通過定量測定熒光量確定新合成DNA的量，從而確定被測抗體樣品中抗體的含量；

(2)將抗原-甲基化DNA模板、DNA多聚酶緩沖液、dNTP混合物和0.5倍的SYBR熒光染料混合均勻后，然后向其中加入抗體樣品于室溫下保持10～15min后，加入DNA多聚酶進行反應(yīng)；所述新合成的DNA能夠與SYBR染料結(jié)合并釋放出熒光，通過定量測定熒光量確定新合成DNA的量，從而確定被測抗體樣品中抗體的含量。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人造DNA復(fù)制調(diào)控開關(guān)用于檢測抗體的應(yīng)用，其特征在于：所述抗體樣品為血清、血漿、唾液、尿液和提取物中的一種。