[發明專利]一種蛋白質結晶裝置和利用該裝置進行蛋白質結晶的方法

無效

• 申請號: 201210133165.7
• 申請日: 2012-05-03
• 公開（公告）號: CN102659916A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 尹大川;陳瑞卿;劉永明;鹿芹芹;何進;馬曉亮;商澎
• 申請（專利權）人: 西北工業大學
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C12N9/00;C12N9/36;C12N9/08;C12N9/50;C12N9/90;C12N9/22;C12N9/56
• 代理公司: 西北工業大學專利中心 61204
• 代理人: 顧潮琪

技術領域

本發明涉及一種用于生物大分子結晶的裝置和方法，特別是用于提高蛋白質結晶條件篩選成功率的裝置和方法，屬于蛋白質結晶領域。

背景技術

后基因組時代的到來，為治療許多難以治愈的疾病帶來了契機。基因組工程以治療人類疾病為新目標，通常不是基因本身而是由基因編碼的蛋白質作為潛在的藥物設計靶點。為了依據蛋白質結構設計藥物，首先必須獲得這些蛋白質的三維分子結構，可見蛋白質的結構對基于結構的理性藥物設計至關重要。當前世界范圍的結構基因組計劃已宣布將測定基因組中所有蛋白質的結構，但迄今為止，僅有部分的蛋白質結構被解析出來。根據公開的蛋白質三維結構數據庫(PDB，www.pdb.org)中的數據可知，X射線單晶衍射技術解析了88％以上的蛋白質結構，在所有生物大分子結構解析技術中占據著最重要的地位。對該技術而言，蛋白質晶體是其必不可少的衍射樣品，然而從純度很高的蛋白質到生長出具備衍射質量蛋白質晶體的成功率不足20％。因此，蛋白質晶體的制備一直以來都是蛋白質結構解析的瓶頸問題之一。

在蛋白質結構解析中，蛋白質晶體的制備通常是通過大量的商業篩選試劑盒分別與蛋白質溶液混合，嘗試尋找出可使蛋白質結晶的條件，再基于此進行結晶條件的優化以獲得衍射質量的晶體。因此蛋白質結晶條件篩選是晶體制備的必經階段。而結晶板及不同的結晶方法對蛋白質結晶條件篩選有很大的影響，因此研發新的蛋白質結晶裝置以及新的結晶方法對于蛋白質結晶條件的篩選是非常必要的。

蛋白質結晶條件的篩選一般采用氣相擴散法。氣相擴散法的原理是在一個封閉體系內，由于不含蛋白質大分子的池液中結晶劑的濃度高于蛋白質大分子結晶液滴中結晶劑的濃度，導致溶劑不斷從低濃度的蛋白質結晶溶液向高濃度的池液擴散，從而使結晶溶液中蛋白質和結晶劑的濃度不斷增加，直到結晶溶液與池液的蒸汽壓達到平衡。在此過程中蛋白質大分子結晶溶液逐漸達到過飽和，從而形成晶體。

氣相擴散法主要包括坐滴法(如圖1)和懸滴法(如圖2)。在氣相擴散的密封體系中，主要包含有體積大且濃度較高、含有沉淀劑的池液，及體積小且濃度較低的蛋白質結晶溶液，一般是較低濃度的結晶溶液與較高濃度的池液通過氣相擴散達到濃度平衡。由于在擴散過程中結晶溶液中蛋白質和沉淀劑的濃度都升高，使蛋白質的溶解度降低且達到一定的過飽和從而發生晶體的形核與生長。一般結晶溶液中的沉淀劑濃度是池液中沉淀劑濃度的1/2，這種情況下，結晶溶液的沉淀劑濃度最大只能擴展到與池液相同的濃度。但是在傳統的氣相擴散法中，雖然結晶溶液濃度不斷濃縮直至與池液平衡，如果池液的濃度不足以使蛋白質結晶溶液濃縮至蛋白質大分子形核的過飽和度，則即使所使用的篩選試劑能在更高濃度下獲得晶體，但在實際篩選時卻得不到晶體。

在蛋白質結晶中，獲得高純度蛋白質比較困難，因此蛋白質是非常珍貴的。在目前高通量的蛋白質結晶條件篩選中，結晶液滴的用量可達到0.05～4μL，結晶溶液的用量很少，非常容易揮發，因此一般實驗室都采用自動化的加樣系統及觀測系統。在蛋白質結晶條件篩選中，通常采用的是符合國際標準的結晶板，符合此標準的結晶板都可實現自動化的加樣以及晶體圖像的采集。

生物大分子結晶條件篩選成功率一般定義為成功結晶的條件數與總的結晶條件數的比值。Chen-Yan?Zhang和Da-Chuan?Yin等人采用Hampton?Research公司貨號為HR2-134的IndexTM?96結晶條件篩選試劑盒對多種蛋白質的結晶條件進行了篩選(Cycling?Temperature?Strategy：A?Method?to?Improve?the?Efficiency?of?Crystallization?Condition?Screening?of?Proteins.Crystal?Growth&Design，2008，8(12)：4227-4232)。該文獻報道的方法中，蛋白質的初始濃度全部為20mg/ml，蛋白質晶體的生長周期為2天。在傳統氣相擴散法-懸滴法下這些蛋白質的結晶條件篩選成功率依次是：溶菌酶結晶條件篩選成功率為29.2％，過氧化氫酶的結晶條件篩選成功率為15.6％，糜蛋白酶原A?II的結晶條件篩選成功率為26％，刀豆球蛋白A?VI的結晶條件篩選成功率為4.2％，蛋白酶K的結晶條件篩選成功率為58.3％，索馬甜蛋白的結晶條件篩選成功率為3.1％，核糖核酸酶A?VII的結晶條件篩選成功率為1％，枯草桿菌蛋白酶A?VII的結晶條件篩選成功率為0。