[發(fā)明專利]一種人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解滅活方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210129270.3 | 申請日： | 2012-04-28 |
| 公開（公告）號： | CN102614508A | 公開（公告）日： | 2012-08-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張雪梅;王亞軍;趙大鵬;李曉波;張賜強;徐文;顧建陽;范宇紅;匡科偉;畢業(yè);任琦;劉蔭;郭占龍;趙志芳;郭雪;劉旭光;孫麗娟;王春鵬;張玉輝;宋澤民;韓俊海;谷麗娟;吳業(yè)宏 | 申請（專利權(quán)）人： | 長春生物制品研究所有限責任公司 |
| 主分類號： | A61K39/145 | 分類號： | A61K39/145;A61P31/16;C12N7/06 |
| 代理公司： | 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100 | 代理人： | 魏征驥 |
| 地址： | 130062 吉林*** | 國省代碼： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 流感病毒 裂解 疫苗 病毒 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，尤其是指一種人用流感病毒裂解疫苗生產(chǎn)中流感病毒單價原液的裂解滅活方法。
背景技術(shù)
流行性感冒(簡稱流感)是由流行性感冒病毒(Influenza?virus)引起的急性呼吸道傳染病,它的特點是爆發(fā)突然、傳染性強，能引起較高的發(fā)病率，并可迅速傳播造成大面積流行，歷史上已經(jīng)記載了4次世界性大流行，而近幾年禽流感（Avian?influenza）的不斷爆發(fā)，2009年甲型H1N1?新型流感的爆發(fā)，進一步加大了各國衛(wèi)生防疫的壓力，引起人們的恐慌。流感是第一個實現(xiàn)全球性監(jiān)測的傳染病，但對其治療卻無特效藥物，疫苗接種是預(yù)防流感流行的有效措施。流感病毒是有包膜病毒，病毒顆粒內(nèi)部為核衣殼，由核蛋白、聚合酶和病毒的基因組RNA組成；包膜由雙層類脂膜、糖蛋白突起和基質(zhì)蛋白組成。流感病毒包膜由來自宿主細胞的雙層類脂膜和流感病毒糖蛋白突起組成，流感病毒糖蛋白突起主要包括血凝素（HA）、神經(jīng)氨酸酶（NA）。HA的抗體能抑制血凝素并能中和病毒，是最主要的保護性抗體。NA的抗體雖不能中和病毒，但能抑制病毒的繁殖，減輕癥狀。目前市場上流感疫苗主要有裂解滅活苗、亞單位疫苗等，其中裂解疫苗免疫效果較好，副作用較小，應(yīng)用最廣。
?目前國內(nèi)外流感病毒的滅活從滅活劑使用上大體可分為以下幾種：
一、β-丙內(nèi)酯滅活：多為國外流感廠家所使用；
二、乙醚滅活：國內(nèi)2家流感疫苗生產(chǎn)企業(yè)及日本某些流感疫苗生產(chǎn)企業(yè)所使用；
三、甲醛滅活：國內(nèi)大多數(shù)流感疫苗企業(yè)及巴斯德所使用，是最早被使用的滅活劑；
而單就以甲醛為滅活劑的滅活方法，其滅活方式又可分為：
一、前滅活：是將流感病毒接種雞胚，收獲尿囊液后即加入甲醛滅活，該滅活方式為最傳統(tǒng)也是國內(nèi)使用最廣的滅活方式。
二、濃縮液階段滅活:是先將流感病毒超濾濃縮后，再加入甲醛滅活。
目前，傳統(tǒng)前滅活工藝中存在如下問題：加入甲醛后，易產(chǎn)生病毒聚團現(xiàn)象，病毒裂解的均勻度不高，病毒裂解效果不佳；滅活時間長，滅活效率低；甲醛的使用量大；滅活操作步驟多，染菌風險高；所需廠房、人力和能耗較大；滅活的均一性和穩(wěn)定性差。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解滅活方法，以解決目前傳統(tǒng)前滅活工藝中存在的病毒裂解效果差、滅活時間長、滅活效率低、滅活劑的用量大、滅活操作步驟多，染菌風險增加、滅活所需廠房、設(shè)施和能耗增加、滅活的均一性和穩(wěn)定性差的問題。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：?
（一）、將梯密度離心純化后的H1N1型、H3N2型或B型單價流感全病毒置于密閉容器中、其蛋白含量控制在2.0-3.0?mg/ml，加入作用濃度為0.7%-0.9%濃度的裂解劑Triton?X-100或作用濃度范圍為0.7-1.2%的Triton?N-101；置20℃-25℃，振蕩裂解；
（二）、采用震蕩裝置進行震蕩，震蕩時間為采用Triton?X-100?震蕩1.5-2.5h,或采用Triton?N-101震蕩4-5h，超濾去除裂解劑；
（三）、病毒滅活：滅活采用pH值7.2、用磷酸鹽緩沖液PBS終濃度為0.1?M/L、EDTA終濃度為0.5mM/L的調(diào)配流感病毒滅活溶液,裂解后病毒液的蛋白濃度0.5-1.0mg/ml，加入終濃度為200ug/ml的甲醛，2-8℃震蕩滅活，滅活時長：4-5天。
本發(fā)明所述的流感病毒滅活溶液是通過下列方法得到的：
（1）2M/L?磷酸鹽緩沖液PBS的配制：
稱取1600g?NaCl、40g?KCl、288g?Na2HPO4和48g?KH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，最后加蒸餾水定容至1L即可；
在15lbf/in2(1034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌40分鐘，保存于室溫或4℃冰箱中；
（2）100mM/L?EDTA溶液的配制：
稱取37.224gEDTA溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，最后加蒸餾水定容至1L即可；
在15lbf/in2(1034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌40分鐘，保存于室溫或4℃冰箱中；
?（3）流感病毒滅活溶液的調(diào)配：
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