[發明專利]豬圓環病毒II型衣殼蛋白基因、表達載體的構建及其蛋白高效表達的方法

有效

• 申請號: 201210128807.4
• 申請日: 2012-04-27
• 公開（公告）號: CN102634525A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 蔡雪輝;涂亞斌;武嘉男
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/63;C12N15/81;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C07K14/01
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

1.一種豬圓環病毒II型衣殼蛋白基因，其特征在于所述的基因具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

2.一種包含權利要求1所述的豬圓環病毒II型衣殼蛋白基因的重組表達載體。

3.如權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于，所述的重組表達載體為甲醇調節型重組酵母表達載體，更優選的，所述的重組表達載體為pPIC9K，所述表達載體pPIC9K含有EcoRI和NotI酶切位點，一個強啟動子AOX1啟動子，一個G418抗性選擇位點。

4.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為包含權利要求1所述的SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列的宿主細胞，或者為包含權利要求2或3所述的重組載體的包含SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸全部或大于150個核苷酸的部分序列的宿主細胞。

5.如權利要求4所述的宿主細胞，其特征在于，所述的細胞為真核細胞，更優選的，所述的細胞為甲醇營養型酵母細胞GS115。

6.權利要求1所述的豬圓環病毒II型衣殼蛋白基因在制備豬圓環病毒II型衣殼蛋白中的應用。

7.一種制備豬圓環病毒II型衣殼蛋白的方法，其特征在于將權利要求1所述的豬圓環病毒II型衣殼蛋白基因克隆至表達載體，然后將得到的重組表達載體轉化宿主菌，進行蛋白的誘導表達，收集純化即得。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)人工合成豬圓環病毒II型衣殼蛋白基因，所述的基因具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；

(2)將合成的豬圓環病毒II型衣殼蛋白基因克隆到酵母表達載體pPIC9K中，電轉化GS?115感受態后，用MD板及G418+YPD平板篩選，激活培養后經甲醇誘導表達并進行無菌檢驗；

(3)無菌收集菌體，加入適量磷酸緩沖液裂解破壁后制備衣殼蛋白，整個過程中進行蛋白無菌檢驗；

(4)測定衣殼蛋白的含量及用陽性血清對其進行免疫檢測。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于在步驟(1)所述的基因的5’端加入了EcoRI限制性內切酶位點，在其3’端加入了Not?I限制性內切酶位點。

10.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述的甲醇誘導表達的條件為每間隔24h加入100％甲醇至甲醇終濃度為0.5-1％(v/v)，即加入量為每毫升培養液中加5-10微升甲醇，進行誘導培養，26-30℃250-300轉/min震蕩培養96～120h，收獲菌體，液氮反復凍融3次后超聲波破碎制備蛋白。