[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)基因魚類細(xì)胞及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210128783.2
• 申請(qǐng)日: 2012-04-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102660508A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭華榮;耿德玉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12Q1/68;C12Q1/02;G01N21/76
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國(guó)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物指示物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因魚類細(xì)胞及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

環(huán)境中的遺傳毒物能直接或間接地?fù)p傷生物體的DNA，使基因和染色體發(fā)生突變而誘發(fā)腫瘤，甚至通過(guò)生殖細(xì)胞將這種損傷傳遞給后代，危害人類健康和動(dòng)植物的生存。因此，建立快速有效的遺傳毒性檢測(cè)技術(shù)和評(píng)價(jià)體系具有重大意義。目前的遺傳毒性的檢測(cè)終點(diǎn)可分為4大類：基因突變、DNA損傷、染色體損傷和染色體組損傷。雖然目前已建立的遺傳毒性檢測(cè)技術(shù)有200多種，但真正經(jīng)過(guò)驗(yàn)證有合適的靈敏度和特異性的檢測(cè)方法只有十幾種。而且由于一種遺傳毒性檢測(cè)方法通常只能反映一個(gè)或兩個(gè)遺傳學(xué)終點(diǎn)，不能涵蓋所有的遺傳學(xué)終點(diǎn)，故要對(duì)某種藥品的遺傳毒性做出準(zhǔn)確評(píng)價(jià)，往往需要進(jìn)行多個(gè)遺傳毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。我國(guó)常用的方法有：微生物回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)(如Ames實(shí)驗(yàn))、哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)、嚙齒動(dòng)物微核實(shí)驗(yàn)和體外真核細(xì)胞基因突變實(shí)驗(yàn)等。如體內(nèi)誘變實(shí)驗(yàn)顯示1個(gè)或以上陽(yáng)性結(jié)果，則還需要進(jìn)行生殖細(xì)胞遺傳毒性測(cè)試。

細(xì)菌Ames實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)基因突變的常用方法，快速簡(jiǎn)便，特異性高，但靈敏性偏低，不能檢測(cè)與真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的遺傳毒性效果，代表性差。微核實(shí)驗(yàn)和染色體畸變實(shí)驗(yàn)涉及到染色體的制備，實(shí)驗(yàn)操作難度大，比較慢。酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變實(shí)驗(yàn)也存在靈敏度低的問(wèn)題。彗星實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)DNA損傷快速靈敏，但假陽(yáng)性率高。活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)如轉(zhuǎn)LacZ基因小鼠突變實(shí)驗(yàn)，成本高，實(shí)驗(yàn)難度大，只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室有能力做。

隨后，為實(shí)現(xiàn)遺傳毒性檢測(cè)的快速和高通量，人們又發(fā)展出報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，即將綠色熒光蛋白基因(GFP)和熒光素酶基因(luc)與DNA損傷反應(yīng)相關(guān)基因的啟動(dòng)子相連接，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷。RAD54基因是酵母細(xì)胞中的DNA損傷修復(fù)基因，目前已有多種以RAD54基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP或luc報(bào)告基因遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)在酵母中建立起來(lái)，并且具有較高的特異性和靈敏性，也適于高通量篩選(Walmsley?et?al.，1997.Yeast?13，1535-1545；Billinton?et?al.，1998.Biosensors?&?Bioelectronics?13，831-838；Liu?et?al.，2008.Mutation?Research?653，63-69)。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，當(dāng)細(xì)胞暴露于具有遺傳毒性的化學(xué)物質(zhì)而出現(xiàn)DNA損傷時(shí)，p53信號(hào)通路可以感受這種損傷信號(hào)，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的水平。p53是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠識(shí)別并激活其下游一系列靶基因的表達(dá)，例如DNA修復(fù)基因P53R2、生長(zhǎng)停滯和DNA修復(fù)基因GADD45a和細(xì)胞周期抑制因子p21基因等，引起細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，進(jìn)行DNA修復(fù)，如果損傷太嚴(yán)重而無(wú)法修復(fù)的話，則啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。因此，p53又是一種腫瘤抑制因子，并被稱為“基因組衛(wèi)士”，在維持基因組的穩(wěn)定上起重要作用。總之，將這些基因的啟動(dòng)子與報(bào)告基因相連，并整合到哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中，得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞就可以用于藥品或環(huán)境樣品的遺傳毒性檢測(cè)。Ohno等(2005，2006)將由P53R2基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶重構(gòu)基因(P53R2-luc)導(dǎo)入人的培養(yǎng)細(xì)胞(p53⁺)中，構(gòu)建了人轉(zhuǎn)基因細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)(Ohno?et?al.，2005.Mutation?Research?588，47-57；Ohno?et?al.，2008.Mutation?Research?656，27-35)。用各種遺傳毒物和非遺傳毒物處理該細(xì)胞，然后檢測(cè)熒光素酶基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，具有很好的專一性和靈敏性。Hastwell等(2006，2009)將GADD45a基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP重構(gòu)基因(GADD45a-GFP)導(dǎo)入人的TK6細(xì)胞(p53⁺)中，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的人轉(zhuǎn)基因細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)具有較高的專一性和靈敏性(Hastwell?et?al.，2006.Mutation?Research?607，160-175；Hastwell?et?al.，2009.Mutagenesis24(5)，455-463)。最近，Zager等(2010)又將p21基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP重構(gòu)基因(p21-GFP)導(dǎo)入人肝癌細(xì)胞HepG2(p53⁺)中，成功構(gòu)建了哺乳動(dòng)物細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)建立在DNA損傷介導(dǎo)的p21基因的表達(dá)基礎(chǔ)上，快速簡(jiǎn)便，具有較高的專一性和靈敏性(Zager?et?al.，2010.Radiol.Oncol.44(1)，42-51)。