[發明專利]神經生長因子活性定量測定方法

有效

• 申請號: 201210125986.6
• 申請日: 2012-04-26
• 公開（公告）號: CN103376248A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 譚淑萍;蔣立新;周志文
• 申請（專利權）人: 舒泰神(北京)生物制藥股份有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶;於毓楨

技術領域

本發明涉及一種神經生長因子活性定量測定方法。

背景技術

神經生長因子(以下簡稱NGF)的活性測定，目前業內采用的方法為雞胚背根神經節法。傳統的雞胚背根神經節法是依據NGF誘導神經節生長、刺激軸突生產的特點而建立，具有特異性強等優點，但該方法檢測每個濃度的NGF需要分離多個神經節，因不是分離后的每個神經節均能受刺激生長軸突，生長軸突的程度也并非一致，只要多個神經節中出現一個終點刺激效應者就可判定效價，操作繁瑣、試驗周期長、結果主觀判定不能定量、重復性差，已不適于對該制品的質控要求，同時其作為一種半定量的方法，也存在一定局限性。

隨著NGF在臨床上的應用不斷增加，生產規模不斷加大，如何快速、簡便且高通量地檢測NGF生物活性成為其質量控制的關鍵。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有較好的準確度和精密度的NGF活性定量測定方法。

本發明所提供的NGF活性定量測定方法，包括以下步驟：

1)將處于對數生長期的TF-1細胞用不含血清和重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的基礎培養基洗滌后重懸，獲得TF-1細胞懸浮液；

2)向梯度稀釋的神經生長因子標準品和待測樣品中分別加入所述TF-1細胞懸浮液，37℃、5％CO₂孵育；然后分別加入指示劑，檢測吸光度/熒光值，繪制標準曲線；

3)通過標準曲線及樣品的吸光度/熒光值計算待測樣品的神經生長因子活性濃度。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，所述步驟1)中獲得的所述TF-1細胞懸浮液還經過在37℃、5％CO₂條件下培養18-20h的步驟。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，所述處于對數生長期的TF-1細胞通過在完全培養基中37℃、5％CO₂條件下培養獲得。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，所述完全培養基為含體積百分含量10％的胎牛血清以及10ng/ml重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的RPMI?1640培養基。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，所述神經生長因子為鼠神經生長因子或人神經生長因子。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，所述指示劑為MTT、MTS或AlamarBlue。MTT全稱為3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，漢語化學名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽。MTS是其類似物，全稱為[3-(4，5-dimethylthiazol-zyl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazol?iuzolium，inner?salt]。

優選地，所述加入指示劑為AlamarBlue。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，加入所述指示劑后，在37℃孵育，然后激發光560nm/發射光590nm檢測熒光值。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，所述TF-1細胞懸浮液的濃度為1.5～2.5×10⁵細胞/ml。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，所述TF-1細胞懸浮液的濃度為2×10⁵細胞/ml。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，所述梯度稀釋的樣品中NGF活性濃度為5～20AU/ml。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，所述不含血清和重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的基礎培養基優選為RPMI?1640培養基。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，步驟1)中所述用不含血清的基礎培養基洗滌的方法為：750rpm離心5min，換液后重復離心，優選重復洗滌3次。

本發明的NGF活性定量測定方法，其中，步驟2)中加入所述TF-1細胞懸浮液，37℃、5％CO₂孵育44～52h，優選為48h。

本發明的NGF活性定量測定方法，具有較好的準確度和精密度。

附圖說明

圖1表示實施例1中繪制的標準曲線。

圖2表示實施例1中樣品稀釋倍數與活性之間的稀釋曲線。

圖3表示實施例2中繪制的標準曲線。

圖4表示實施例2中樣品稀釋倍數與活性之間的稀釋曲線。

具體實施方式