[發明專利]一種參與丁醇生成的醇脫氫酶及其應用

無效

• 申請號: 201210122975.2
• 申請日: 2012-04-24
• 公開（公告）號: CN103374589A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 趙蒙;蔣宇;楊晟;姜衛紅
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12P7/16;C12R1/145
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 祝蓮君;雷芳

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及一種參與丁醇生成的醇脫氫酶及其應用。

背景技術

醇脫氫酶(ADH；EC?1.1.1.1，1.1.1.2，或1.1.1.71)是生物體中丁醇、乙醇、異丙醇等代謝途徑的關鍵酶。醇脫氫酶催化醛或酮還原生成相應的初級或次級醇，其反應式如下：醇是厭氧代謝中一種普遍產物，同時代謝中間物作為電子受體接受電子從而再生輔酶NAD(P)⁺。

超過半數的梭菌屬菌可以產生一種或多種醇：如甲醇，乙醇，丙醇，異丙醇，n-丁醇，異丁醇(2-甲基-1-丁醇)和異戊醇(3-甲基-1-丁醇)等，其中丁醇和乙醇是最常見的兩種產物。丙酮丁醇梭菌(Clostridium?acetobutylicum)屬于革蘭氏陽性菌，GC含量30.9％，2001年完成全基因組測序。它是一類產孢子的厭氧梭菌，能發酵產生丙酮、乙醇和丁醇等溶劑。在丙酮丁醇發酵過程中，丁醇是最具經濟價值的溶劑。為提高生物丁醇相對化學法生產的經濟性，一方面可以開發利用廉價底物的工程菌，另一方面可以提高發酵產物中高副加值產品丁醇的比例，從而提高產物/原料轉化率。一般的丙酮丁醇梭菌如ATCC?824在發酵生產溶劑的過程中，丁醇的比例約為60％左右。通過土樣分離、化學誘變及抗性篩選，及代謝工程改造，敲除丙酮生成途徑關鍵酶，產丁醇比例進一步提高到80％。

為進一步增加產物丁醇的比例，有必要進一步降低副產物乙醇的產生，對醇脫氫酶的功能鑒定就至關重要。由于醇脫氫酶的底物特異性、催化活性大小、表達量與生物丁醇/乙醇的產量緊密相關，同時醇脫氫酶與微生物細胞內重要代謝輔因子NAD(P)+/NAD(P)H動態平衡的維持關系密切。對醇脫氫酶基因、表達調控、酶學性質、蛋白質結構等方面研究對丁醇代謝工程的改造具有重要的意義。因此目前本領域迫切需要對參與調控丁醇產生的醇脫氫酶進行鑒定和功能驗證。

發明內容

本發明的目的就是提供一種參與丁醇生成的醇脫氫酶及其應用。

在本發明的第一方面，提供了一種分離的CA_C3375醇脫氫酶或其編碼基因的用途，它被用于調節丙酮丁醇梭菌產生溶劑的能力。

在另一優選例中，所述的調節包括：上調(或提高)和下調(或降低)。

在另一優選例中，所述的溶劑選自下組：乙醇，丙酮，丁醇，或其組合。

在另一優選例中，所述的溶劑為丁醇。

在另一優選例中，所述的CA_C3375醇脫氫酶選自下組：(i)具有SEQ?ID?NO.：29所示氨基酸序列的多肽；(ii)將SEQ?ID?NO.：29所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列與SEQ?ID?NO.：29所示氨基酸序列的同源性≥90％(較佳地≥95％，更佳地≥97％，更佳地≥99％)、由(1)衍生的多肽。

在另一優選例中，所述CA_C3375醇脫氫酶的編碼基因是選自下組的一種或多種：(1)編碼如SEQ?ID?NO.：29所述多肽的多核苷酸；(2)序列如SEQ?ID?NO.：1所示的多核苷酸；(3)序列與SEQ?ID?NO.：1所示序列的同源性≥95％(較佳地≥97％，更佳的≥99％)的多核苷酸；(4)與(1)-(3)任一所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸。

在本發明的第二方面，提供了一種提高丙酮丁醇梭菌產生丁醇能力的方法，包括步驟：提高丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脫氫酶基因的表達水平，或提高丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脫氫酶的活性。

在另一優選例中，所述的提高是指，與野生型丙酮丁醇梭菌相比，CA_C3375醇脫氫酶基因的mRNA表達水平提高10％以上，或CA_C3375醇脫氫酶的表達或活性上升10％以上。

在另一優選例中，所述的提高通過選自下組的一種或多種方式實現：導入額外的CA_C3375醇脫氫酶、引入提高CA_C3375醇脫氫酶的表達或活力的突變、或引入瞬時表達CA_C3375醇脫氫酶的表達載體。

在本發明的第三方面，提供了一種丙酮丁醇梭菌，所述丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脫氫酶基因的表達水平或CA_C3375醇脫氫酶的活性提高。

在另一優選例中，所述的提高是指，與野生型丙酮丁醇梭菌相比，CA_C3375醇脫氫酶基因的mRNA表達水平提高10-100％，或CA_C3375醇脫氫酶的表達或活性提高10-100％。