[發(fā)明專利]一種基于PCR-DGGE技術(shù)確定魚類地理來源的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210122661.2
• 申請日: 2012-04-25
• 公開（公告）號: CN102653791A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郁二蒙;謝駿;王廣軍;余德光;王海英;龔?fù)麑?/a>;李志斐;夏耘
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 廣州弘邦專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44236
• 代理人: 張釔斌

1.一種基于PCR-DGGE技術(shù)確定魚類地理來源的方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）樣本采集及處理；（2）腸道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA的提??；（3）PCR擴增及純化；（4）DGGE成像；（5）目的條帶的回收、克隆及測序；（6）分析。

2.如權(quán)利要求1所述的一種基于PCR-DGGE技術(shù)確定魚類地理來源的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）樣本采集及處理：每種魚類需要n個重復(fù)樣本，其中，n大于5，分別收集每個樣本的腸道內(nèi)容物，將n個重復(fù)樣本的腸道內(nèi)容物混合均勻后保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）腸道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA的提?。耗c道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA的提取采用Stool?Mini?Kit?試劑盒；

（3）PCR擴增及純化：根據(jù)細(xì)菌16S?rDNA?V3可變區(qū)設(shè)計一對通用引物，其中，在上游引物的5’末端添加一個30-40?bp的GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使用引物對腸道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA進行PCR擴增；

（4）DGGE成像：PCR產(chǎn)物采用Bio-Rad?DCodeTM突變檢測系統(tǒng)進行DGGE凝膠電泳，其中凝膠梯度為35?％～55?％，緩沖液為1×TAE?Buffer，變性方向與電泳方向一致，銀染，然后利用白光投射儀對凝膠進行成像，并用軟件BIO-RAD?Quantity?One?4.3.1進行圖像分析，其中，每條DGGE泳道代表的是腸道內(nèi)容物細(xì)菌的平均狀態(tài)，不同位置的條帶代表不同的細(xì)菌，而條帶亮度反映細(xì)菌的相對量；

（5）目的條帶的回收、克隆及測序：將腸道內(nèi)容物細(xì)菌DGGE圖譜中清晰的共性和特異條帶標(biāo)記割膠回收，加入TE(pH?8.0)浸泡過夜取上清作模板進行擴增，所用引物為在所述步驟（2）的通用引物基礎(chǔ)上將上游引物去掉添加的GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)，將得到的PCR產(chǎn)物純化，與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆子測序；

（6）分析：將測序的序列利用BLAST程序進行相似性分析，確定魚類腸道內(nèi)容物的特異菌；利用從構(gòu)建的腸道內(nèi)容物細(xì)菌特異性DGGE圖譜得出的可見條帶的數(shù)目、亮度、位置等特異性數(shù)據(jù)，追溯魚類地理來源，同時確定的魚類腸道內(nèi)容物的特異菌作為魚類地理來源的參考指標(biāo)。

3.如權(quán)利要求2所述的一種基于PCR-DGGE技術(shù)確定魚類地理來源的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）樣本采集及處理：每種魚類需要n個重復(fù)樣本，其中，n大于5，分別收集每個樣本的腸道內(nèi)容物，將n個重復(fù)樣本的腸道內(nèi)容物混合均勻后保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）腸道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA的分別提取：腸道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA的提取采用Stool?Mini?Kit?試劑盒；

（3）PCR擴增及純化：根據(jù)細(xì)菌16S?rDNA?V3可變區(qū)設(shè)計一對通用引物，其中，在上游引物的5’末端添加一個30-40?bp的GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物為V338?F-GC：5-CGCCC?GCCGC?GCGCG?GCGGG?CGGGG?CGGGG?GCACG?GGGGG?ACTCC?TACGG?GAGGC?AGCAG-3及V534?R：5-ATTAC?CGCGG?CTGCT?GG-3，使用引物V338F-GC和V534R對腸道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：dNTP?Mixture（10mmol/L）1?μL，10×PCR?Buffer（含Mg²⁺）?5?μL，V338?F-GC（20nmol/μL）1?μL，V534R（20nmol/μL）?1?μL，Taq?酶（5?U/μL）0.5?μL，模板?DNA?1?μL，加雙蒸水至50?μL，PCR反應(yīng)條件為：94?℃預(yù)變性?5?min；94?℃變性30?s，65~55?℃退火30?s（每個循環(huán)降落0.5?℃），72?℃延伸1?min，20個循環(huán)；94?℃變性?30?s，55?℃退火?30?s，72?℃延伸1?min，10個循環(huán)；72?℃延伸10?min；

（4）DGGE成像：PCR產(chǎn)物采用Bio-Rad?DCodeTM突變檢測系統(tǒng)進行DGGE凝膠電泳，其中凝膠梯度為35?％～55?％，緩沖液為1×TAE?Buffer，變性方向與電泳方向一致，電泳條件：電泳溫度為60?℃，首先在200?V下電泳?5?min，然后在?80?V?電泳?12?h，銀染，然后利用白光投射儀對凝膠進行成像，并用軟件BIO-RAD?Quantity?One?4.3.1進行圖像分析，其中每條DGGE泳道代表的是腸道內(nèi)容物細(xì)菌的平均狀態(tài)，不同位置的條帶代表不同的細(xì)菌，而條帶亮度反映細(xì)菌的相對量；

（5）目的條帶的回收、克隆及測序：將腸道內(nèi)容物細(xì)菌DGGE圖譜中清晰的共性和特異條帶標(biāo)記割膠回收，加入TE(pH?8.0)浸泡過夜取上清作模板進行擴增，所用引物為V338F：5-ACTCC?TACGG?GAGGC?AGCAG-3及V534R：5-ATTAC?CGCGG?CTGCT?GG-3，反應(yīng)體系為：dNTP?Mixture（10mmol/L）1?μL，10×PCR?Buffer（含Mg2+）?5?μL，V338F（20nmol/μL）?1?μL，V534R（20nmol/μL）?1?μL，Taq?酶（5?U/μL）0.5?μL，模板?DNA?1?μL，加雙蒸水至50?μL，PCR反應(yīng)條件為：94?℃預(yù)變性5?min；94?℃變性30?s，65~55?℃退火30?s（每個循環(huán)降落0.5℃），72?℃延伸1min，20個循環(huán)；94?℃變性?30?s，55?℃退火30?s，72?℃?延伸1?min，10個循環(huán)；72?℃延伸10?min，將得到的PCR產(chǎn)物純化，與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆子測序；

（6）分析：將測序的序列利用BLAST程序進行相似性分析，確定魚類腸道內(nèi)容物的特異菌；利用從構(gòu)建的腸道內(nèi)容物細(xì)菌特異性DGGE圖譜得出的可見條帶的數(shù)目、亮度、位置等特異性數(shù)據(jù)，追溯魚類地理來源，同時確定的魚類腸道內(nèi)容物的特異菌作為魚類地理來源的參考指標(biāo)。

4.如權(quán)利要求1-3所述的一種基于PCR-DGGE技術(shù)確定魚類地理來源的方法，其特征在于，在所述方法中還包括收集腸道壁、提取腸道壁細(xì)菌總DNA、對腸道壁細(xì)菌總DNA進行PCR擴增及純化、腸道壁細(xì)菌DGGE成像，及結(jié)合腸道壁細(xì)菌DGGE圖譜進行魚類地理來源的確定，具體包括以下步驟：

（1）樣本采集及處理：每種魚類需要n個重復(fù)樣本，其中，n大于5，分別收集每個樣本的腸道內(nèi)容物，將n個重復(fù)樣本的腸道內(nèi)容物及腸道壁分別混合均勻后保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）腸道壁細(xì)菌總DNA及腸道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA的分別提取：腸道壁細(xì)菌總DNA的提取流程為：用無菌剪刀剪取1g的片段，放于滅菌離心管A中，加入1ml?1×TE?Buffer，最大轉(zhuǎn)速渦旋5min重懸菌體至溶液，盡量轉(zhuǎn)移上清液至新的2ml離心管中，再加入1ml?1×TE?Buffer至原離心管A中，重復(fù)所述操作；腸道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA的提取采用Stool?Mini?Kit?試劑盒；

（3）PCR擴增及純化：根據(jù)細(xì)菌16S?rDNA?V3可變區(qū)設(shè)計一對通用引物，其中，在上游引物的5’末端添加一個30-40bp的GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物為V338?F-GC：5-CGCCC?GCCGC?GCGCG?GCGGG?CGGGG?CGGGG?GCACG?GGGGG?ACTCC?TACGG?GAGGC?AGCAG-3及V534?R：5-ATTAC?CGCGG?CTGCT?GG-3，使用引物V338F-GC和V534R對腸道壁細(xì)菌總DNA及腸道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA分別進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：dNTP?Mixture（10mmol/L）1?μL，10×PCR?Buffer（含Mg²⁺）?5?μL，V338?F-GC（20nmol/μL）1?μL，V534R（20nmol/μL）?1?μL，Taq?酶（5?U/μL）0.5?μL，模板?DNA?1?μL，加雙蒸水至50?μL，PCR反應(yīng)條件為：94?℃預(yù)變性?5?min；94?℃變性30?s，65~55?℃退火30?s（每個循環(huán)降落0.5?℃），72?℃延伸1?min，20個循環(huán)；94?℃變性?30?s，55?℃退火?30?s，72?℃延伸1?min，10個循環(huán)；72?℃延伸10?min；

（4）DGGE成像：PCR產(chǎn)物采用Bio-Rad?DCodeTM突變檢測系統(tǒng)進行DGGE凝膠電泳，其中凝膠梯度為35?％～55?％，緩沖液為1×TAE?Buffer，變性方向與電泳方向一致，電泳條件為：電泳溫度為60?℃，首先在200?V下電泳?5?min，然后在?80?V?電泳?12?h，銀染，然后利用白光投射儀對凝膠進行成像，并用軟件BIO-RAD?Quantity?One?4.3.1進行圖像分析，其中每條DGGE泳道代表的是腸道壁細(xì)菌或腸道內(nèi)容物細(xì)菌的平均狀態(tài)，不同位置的條帶代表不同的細(xì)菌，而條帶亮度反映細(xì)菌的相對量；

（5）目的條帶的回收、克隆及測序：將腸道內(nèi)容物細(xì)菌DGGE圖譜中清晰的共性和特異條帶標(biāo)記割膠回收，加入TE(pH?8.0)浸泡過夜取上清作模板進行擴增，所用引物為V338F：5-ACTCC?TACGG?GAGGC?AGCAG-3及V534R：5-ATTAC?CGCGG?CTGCT?GG-3，反應(yīng)體系為：dNTP?Mixture（10mmol/L）1?μL，10×PCR?Buffer（含Mg2+）?5?μL，V338F（20nmol/μL）?1?μL，V534R（20nmol/μL）?1?μL，Taq?酶（5?U/μL）0.5?μL，模板?DNA?1?μL，加雙蒸水至50?μL，PCR反應(yīng)條件為：94?℃預(yù)變性5?min；94?℃變性30?s，65~55?℃退火30?s（每個循環(huán)降落0.5℃），72?℃延伸1min，20個循環(huán)；94?℃變性?30?s，55?℃退火30?s，72?℃?延伸1?min，10個循環(huán)；72?℃延伸10?min，將得到的PCR產(chǎn)物純化，與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆子測序；

（6）分析：將測序的序列利用BLAST程序進行相似性分析，確定魚類腸道內(nèi)容物的特異菌；利用從構(gòu)建的腸道內(nèi)容物細(xì)菌特異性DGGE圖譜及腸道壁細(xì)菌特異性DGGE圖譜得出的可見條帶的數(shù)目、亮度、位置等特異性數(shù)據(jù)，追溯魚類地理來源，同時確定的魚類腸道內(nèi)容物的特異菌作為魚類地理來源的參考指標(biāo)。