[發明專利]RecA介導的特異性目的DNA片段捕獲方法

無效

• 申請號: 201210120141.8
• 申請日: 2012-04-20
• 公開（公告）號: CN103374565A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 于文強;張如奎
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬分子生物學-生物化學技術領域，涉及捕獲樣品中的同源目標DNA片段的方法，尤其涉及在RecA的介導下特異性捕獲樣品中的同源目標DNA片段的方法。該方法可用于外顯子或其他目的片段的捕獲測序，為腫瘤和其他疾病罕見的突變位點檢測提供技術幫助。

背景技術

研究顯示，外顯子測序為疾病檢測和機理研究提供了更為有效的技術手段，與傳統的人類全基因組測序相比，外顯子測序在檢測新的致病基因，特別是罕見的基因變異，表現出很高的檢測效率。據報道，通過外顯子測序，能夠辨別出一系列全基因組測序可能遺漏的少見的單核苷酸多態性變異(SNPs)，DNA錯義突變以及基因序列的插入和缺失。但是外顯子測序的高費用和高時耗依然是限制其大規模使用的重要因素，而且外顯子測序時探針雜交易出現非特異性，探針設計時需考慮Tm值以使其具有均一的覆蓋度，所需樣品初始量相對較大，諸多因素嚴重限制了其在臨床疾病研究中的大規模應用。

現有技術公開了如下信息：在生物的進化過程中，同源重組是遺傳信息改變過程中的一個重要的發生事件。同源重組是指兩條具有同源性的DNA，通過堿基配對，鏈斷裂和再連接，從而引起DNA片段重新組合的過程。生物的各種代謝過程都是在酶和各種蛋白因子的幫助下高效特性的完成的。有研究顯示，RecA蛋白是大腸桿菌中參與同源重組最重要的因子；在真核生物中，與RecA同源的Rad51基因以及一系列的相關基因，參與真核生物的同源重組過程；RecA蛋白在原核生物同源重組過程中，以首尾相連的方式覆蓋在DNA單鏈上；每個RecA分子結合3個核苷酸，這種RecA單鏈復合物可以和雙鏈DNA結合并掃描其同源序列；當發現同源序列后，雙鏈DNA解螺旋，單鏈DNA在RecA帶領下侵入解螺旋的雙鏈DNA分子，入侵單鏈與雙鏈DNA中的互補序列發生堿基配對，序列相同的DNA鏈被置換出來，鏈的置換效率和探針-目的DNA的同源長度以及目的DNA的三維構象有關系；置換方向沿著5’-3’的方向進行，其中探針3，端堿基必須嚴格配對；同源重組過程由RecA水解ATP提供能量，當用ATP-γ-S代替ATP時，則無法水解，反應阻抑在三鏈復合體的過渡態。

發明內容

本發明的目的是提供一種RecA介導的特異性目的DNA片段捕獲方法。本發明利用所述的穩定的三鏈復合體，設計同源探針以捕獲目的DNA片段，進而分離和純化與目的DNA片段上結合的蛋白調控因子和具有調控作用的RNA分子，通過捕獲靶基因片段進行高通量基因測序進行樣本制備。

本發明中，根據RecA在體內同源重組中的作用模式，尤其是在原核生物大腸桿菌中介導同源重組的作用模式，在體外模擬其過程，設計針對目的DNA片段中58bp長度的同源DNA序列為探針，在含有RecA和ATP-γ-S的反應體系中特異性的捕獲樣品中的同源目標DNA片段。

本發明中，采用ATP和H₂O解除RecA介導的穩定的三鏈復合體而作為高效的洗脫試劑，其中Mg²⁺和Ca²⁺為穩定形成三鏈復合體所必須，而ATP對三鏈復合體的形成具有顯著的抑制作用，室溫下用H₂O可以特異性的洗脫目標DNA片段，本發明方法可提高洗脫效率，減少高溫變性等較強烈洗脫條件下的非特異性問題。

更具體的，本發明的RecA介導的特異性目的DNA片段捕獲方法，其包括步驟：設計探針預先與RecA在37℃孵育，然后加入含有目標樣品的DNA繼續孵育，加入含有0.2％的NP40的1×RecA緩沖液洗滌非特異性DNA，最后通過洗脫試劑特異性地洗脫目的DNA片段。

本發明中，所述的樣品是指經過酶切或超聲將基因組斷裂成500-1000bp的DNA片段。

本發明中，洗脫試劑選自ATP或H₂O，所述的ATP和H₂O分別對RecA介導形成的三鏈復合體具有解除穩定的作用，通過ATP或H₂O進行洗脫探針捕獲目的DNA片段。

本發明中，洗滌非特異性的緩沖液中，含有Ca²⁺或Mg²⁺等二價陽離子，所述的二價陽離子是維持穩定的目的片段參與形成的三鏈復合體所必須的。

本方法可用于外顯子或其他目的片段的捕獲測序，為腫瘤和其他疾病罕見的突變位點檢測提供技術改進，能避免目前外顯子或其他目的片段捕獲過程中探針設計需要Tm值均一性，探針雜交具有非特異性，所需樣品初始量相對較大等問題。