[發明專利]攜帶O型口蹄疫病毒B細胞表位的VP60蛋白重組桿狀病毒

有效

• 申請號: 201210111344.0
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN102604898A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 王芳;盛蓉;范志宇;胡波;魏后軍;薛家兵;姜平
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C07K19/00;A61K39/135;A61P31/14;G01N33/569
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

?

技術領域

????本發明涉及攜帶O型口蹄疫病毒B細胞表位的兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60重組桿狀病毒及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

病毒樣顆粒（virus-like?particles，VLPs）由多拷貝的一種或幾種病毒結構蛋白聚合而成，多為桿狀或二十面體，直徑大約在25～100nm之間，其結構和抗原性均與活病毒顆粒保持相同。VLPs由一種或幾種結構蛋白多聚而成，因此，其表面抗原以一種有序和重復的方式被展示，這種展示可快速顯著地誘導高水平的免疫應答。另外，VLPs大小適中，可有效被樹突狀細胞等抗原遞呈細胞識別捕獲，從而誘導更有效的免疫應答。VLPs易純化，可通過密度梯度離心或尺寸色譜法純化。基于這些優點，VLPs已成為疫苗研究的熱點。兔出血癥（Rabbit?Hemorrhagic?Disease，RHD）是由兔出血癥病毒（RHDV）引起的兔的傳染性疾病，病程短、死亡率高，是家兔烈性傳染病。VP60蛋白是RHDV主要的結構蛋白，在動物體內可誘導產生中和抗體，是病毒免疫保護性抗原。研究發現在沒有其他任何成分存在的條件下，VP60衣殼蛋白在體外可自然聚合成不包裹核酸的、與天然RHDV粒子在物理形態上類似的VLPs。這種VLPs具有很好的免疫原性，本身就可作為免疫佐劑，可以以胞吞或胞飲途徑進入抗原提呈細胞，分別誘導體液免疫應答和細胞免疫應答。研究表明，這種病毒樣顆粒可嵌合表達外源基因并作為疫苗載體，這就使RHDV?VP60作為其他動物疾病甚至人類疾病的VLPs疫苗載體成為可能。

口蹄疫（foot-and-mouth?disease?virus，FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的牛、羊、豬等家畜急性、熱性、高度接觸性傳染病。由于其傳播快，不僅給畜牧業造成了巨大的經濟損失，而且嚴重影響國際貿易，世界動物衛生組織將其列為必須上報的疫病之一。FMD?血清型眾多，包括?O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和?SAT?3?型共?7?個血清型，血清型間無交叉保護，控制難度較大。2003年歐盟修訂了FMD防控策略，肯定了疫苗免疫在FMD爆發時的作用，隨后歐盟多個國家將疫苗免疫作為補充手段用于FMD的控制。滅活疫苗在歐美等地的FMD防制和根除中發揮了重要的作用，直到今天，滅活疫苗仍然是成功防控FMD的重要措施。但也有不足之處：對于有效的免疫，疫苗的抗原含量要保證，生物安全防護級別較高，滅活不完全可能導致散毒，疫苗存在病毒毒力返強等，另外，滅活疫苗的生產成本較高。加快安全有效的新型口蹄疫疫苗開發研究，對于成功預防、控制乃至最終消滅口蹄疫是十分必要的。隨著生物技術的發展，基因工程疫苗是未來的發展方向，并已經取得了一定的成果。研究表明，O型FMDV?VP1至少有5個B細胞表位，其中最重要的一個表位由VP1的141～160位(G-H環)和C端200～213位氨基酸殘基線性表位組成，為最重要的B細胞表位，也是FMDV最重要的抗原位點。復旦大學、上海畜牧獸醫研究所的科研人員發明了一種家畜口蹄疫病毒多肽疫苗。該多肽疫苗是用化學方法合成編碼VP1蛋白中有免疫原性的141～160位氨基酸和200～213位氨基酸的小肽基團，將其串聯，再插入質粒載體大分子上轉入細菌表達，經過發酵即得抗口蹄疫病毒疫苗，在我國口蹄疫的預防中起到重要的作用。我們課題組在RHDV衣殼蛋白VP60基因的不同位置分別插入單個外源B細胞表位（FMDV?VP1?B細胞表位200～213aa）和雙串聯B細胞表位（FMDV?VP1（141～160aa）-GS-（200～213aa）），構建6種重組轉移載體并在Sf9細胞中進行表達，通過電鏡觀察和動物實驗，研究加入這些外源片段對VLPs的組裝及外源片段的免疫原性，結果發現，與其他插入位點相比，在RHDV衣殼蛋白VP60基因的N-端插入單個外源B細胞表位（FMDV?VP1?B細胞表位200～213aa），重組病毒表達的嵌合蛋白可形成VLPs，表明衣殼蛋白VP60本身具有疫苗載體性質，可以在不改變結構的情況下攜帶外源片段；嵌合蛋白具有與VP60蛋白相同的對人“O”紅細胞凝集特性，易于疫苗抗原的定量與檢測；動物實驗顯示嵌合蛋白在小鼠體內能誘導產生抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白陽性抗體。

發明內容

技術問題??本發明的目的是通過分子生物學技術構建重組桿狀病毒載體，提供一種免疫效果好、工藝簡便的攜帶口蹄疫病毒B細胞表位的兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60重組桿狀病毒及病毒樣粒子疫苗的制備方法。

技術方案