[發明專利]一種利用香菇液體發酵生產漆酶的方法

無效

• 申請號: 201210111263.0
• 申請日: 2012-04-16
• 公開（公告）號: CN102618512A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 姚強;宮志遠;單洪濤;韓建東;王琦;高能;孫濤;萬魯長;任鵬飛;曲玲;任海霞
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院農業資源與環境研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12R1/645
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 趙龍群

技術領域

本發明涉及一種利用香菇液體發酵生產工業用酶制劑漆酶的方法，屬于生物發酵工程技術領域。

背景技術

漆酶(Laccase，P-diphenol?oxidase，EC?1.10.3.2)是一類結合多個銅離子的蛋白質，屬于銅藍氧化酶，存在菇、菌及植物中，其中以擔子菌中的白腐菌中分布最為廣泛。漆酶可存活于空氣中，發生反應后唯一的產物是水，是一種環保型酵素。由于環保意識逐漸被人所重視，因此近年來漆酶國內外研究較熱。真菌漆酶一般含有4個銅離子，其氧化還原電位比昆蟲和植物漆酶高，可以氧化多種酚類、芳胺類、羧酸類、甾體激素與生物色素、金屬有機化合物和一些非酚類底物，在廢水處理、紙漿漂白、土壤凈化、染料脫色、免疫檢測等諸多現代工業領域里都能廣泛應用。香菇(Lentinula?edodes)又名香蕈，屬擔子菌綱，傘菌目，蘑菇科，皮裥屬，學名香皮裥菌，在我國已有悠久的生產栽培歷史。我國是全球最大的香菇生產國，目前在我國70％以上的省份均有栽培香菇，因此香菇具有價格低、產地多、易于培養的特點。香菇作為一種白腐真菌已被證明可以產生漆酶，而且其中包括多種同工酶，合稱為總漆酶，且其酶的氧化還原活力比昆蟲漆酶、植物漆酶都要高出很多。相比直接從香菇子實體中提取，低成本、高效的液體發酵技術是目前工業化發酵生產的發展方向，然而當前相關香菇發酵生產漆酶的研究很少，而且與香菇其它活性成分的發酵提取生產相比，其漆酶的產量仍然偏低，同時酶活性受到培養條件和基質成分等諸多因素的制約。已有報道利用芳香類化合物或重金屬離子誘導提高產量，但是這些誘導物一般都具有毒性，且難于降解，添加后使發酵液處理成本增高，還易造成環境污染。利用液體靜置培養或固態發酵技術能夠緩解漆酶生產的環境污染問題，但發酵周期太長，不適合工業化發酵生產應用。

如中國專利文獻CN1463578A(申請號02124094)，公開了一種香菇液體菌種的深層發酵培養方法及其培養基涉及菌種深層發酵培養方法及其培養基。該培養方法包括(1)將母種在母種培養基內進行培養；(2)將在母種培養基內培養長滿試管的菌絲移種到木屑原種培養基內進行過渡培養，培養條件為：溫度22～27±1℃，暗培養12～20天，待菌絲長滿，(3)將木屑菌種充分打碎后立即移種到液體培養基中進行一級搖瓶的培養擴增；(4)將一級搖瓶內生長5～7天的菌液移入盛有新鮮液體培養基的二級搖瓶中進行擴增；(5)將二級搖瓶出來的菌液進行發酵處理即可得到成品香菇液體菌種。其它一些利用漆酶基因的異源表達的產量往往也低于野生菌。因此，這些都限制了目前漆酶的工業化生產應用，急需開發一種新的能夠提高漆酶產率、降低生產成本的制備方法和生產工藝以滿足現代工業化的需要。

近年來在植物細胞壁中發現一類稱為擴張蛋白的新蛋白種類。研究表明，擴張蛋白在植物形態建成(Fleming?et?al.，1999)、果實成熟(Cosgrove，2000)、根毛發生(Cho?and?Cosgrove，2002)、細胞擴張(Cosgrove，1998)、滲透調節(Wu?and?Cosgrove，2000)和禾本科植物花粉管生長(Cosgrove，1997)等諸多方面均起著極為重要的作用。在擬南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多種植物中均已發現擴張蛋白，被認為其普遍存在于各種雙子葉和單子葉植物的細胞壁中。試驗證明這種植物細胞壁蛋白有使熱鈍化的離體細胞壁恢復伸展的功能，推測其能夠打斷細胞壁多聚物之間的氫鍵進而調節酸依賴的細胞壁延展和壓力松弛等生理活動，可能在植物生長過程中起生理調控和細胞壁延伸等調控作用。然而，關于擴張蛋白的作用機制目前仍未有明確定論，將擴張蛋白應用于香菇的液體發酵進行漆酶等次生代謝產物的生產國內外目前均未見報道。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種利用香菇液體發酵生產漆酶的方法。

本發明技術方案如下：

一種利用香菇液體發酵生產漆酶的方法，包括如下步驟：

(1)將香菇菌種接種到PD液體發酵培養基中，進行活化培養，得種子液；

(2)將步驟(1)制得的種子液按5～15％體積比接種于液體發酵培養基中，在溫度25～30℃的條件下，液體發酵培養1～5天，然后加入擴張蛋白溶液，使擴張蛋白的濃度為1.0～3.0mg/mL，然后繼續培養4～8天，分離，取上清液，得到發酵液；

(3)從步驟(2)制得的發酵液中提取漆酶。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中的PD液體發酵培養基，每升組分如下：

去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g，蒸餾水定容至1000mL。