[發明專利]一種利用香菇液體發酵生產漆酶的方法

無效

• 申請號: 201210111263.0
• 申請日: 2012-04-16
• 公開（公告）號: CN102618512A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 姚強;宮志遠;單洪濤;韓建東;王琦;高能;孫濤;萬魯長;任鵬飛;曲玲;任海霞
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院農業資源與環境研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12R1/645
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 趙龍群

1.一種利用香菇液體發酵生產漆酶的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將香菇菌種接種到PD液體發酵培養基中，進行活化培養，得種子液；

(2)將步驟(1)制得的種子液按5～15％體積比接種于液體發酵培養基中，在溫度25～30℃的條件下，液體發酵培養1～5天，然后加入擴張蛋白溶液，使擴張蛋白的濃度為1.0～3.0mg/mL，然后繼續培養4～8天，分離，取上清液，得到發酵液；

(3)從步驟(2)制得的發酵液中提取漆酶。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的活化培養條件為：搖床轉速100～180r/min，溫度25～30℃，時間3～6天。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的液體發酵培養基，每升組分如下：

玉米粉100g，麩皮100g，蔗糖20g，白糖10g，蛋白胨2g，MgSO₄·7H₂O?0.5g，KH₂PO₄0.5g，水定容至1000ml，pH?5.0～7.0。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為1.5～3.0mg/mL；進一步優選2.0～3.0mg/mL。最優選的，所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為2.5mg/mL。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的擴張蛋白溶液按照如下方法制備：

將大豆或黃瓜種子經0.05～0.15wt％HgCl₂消毒4～6min，流水沖洗5～7h，然后，25～28℃暗培養4～6天；剪取幼苗下胚軸頂端3～4cm，置-20℃預冷0.5h，加預冷至4℃的勻漿緩沖液，勻漿后，用孔徑70μm的尼龍網過濾，濾渣經勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置1～3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，4℃下提取44～50h，過濾，按0.3～0.5g/mL的添加量向濾液中緩慢添加(NH₄)₂SO₄，添加(NH₄)₂SO₄過程中不斷攪拌，防止(NH₄)₂SO₄局部過飽和，然后靜置25～30h，4℃條件下25000g離心5～10min，沉淀用酸性緩沖液復溶，4℃下分子量3000Da的透析袋透析，透析液經20000g離心10min，取上清液即為制備的擴張蛋白溶液。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液組分為：25mmol/L?4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1.5mmol/L?Na₂S₂O₅，2mmol/L乙二胺四乙酸，0.1wt％Triton?X-100，pH?7.0；所述提取液組分為：15mmol/L?4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1.0mmol/L乙二胺四乙酸，1.5mmol/LNa₂S₂O₅，0.5mol/L?NaCl，pH?6.0；所述酸性緩沖液配制是：將2.05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調節pH至4.0，水定容至1L。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的分離是將發酵液經4～6層紗布過濾，4℃、8000r/min離心15min。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，從發酵液中提取漆酶的步驟如下：

向步驟(2)制得的發酵液中0～4℃下按0.3～0.5g/mL的添加量向發酵液中緩慢添加研磨后的(NH₄)₂SO₄，4℃沉淀6～8h，于4℃10000rpm離心20min，棄上清液，將沉淀溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中；4℃用截留分子量為10～20kDa的透析袋透析，然后4℃條件下用截留分子量為10～20kDa的透析膜進行超濾濃縮，除去小分子的蛋白質，即得香菇漆酶酶液。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制方法是：將0.69g磷酸二氫鈉、0.012g檸檬酸溶于蒸餾水中，定容至1L，pH?8.0。