[發(fā)明專利]微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫果膠酶的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210109573.9
• 申請日: 2012-04-13
• 公開（公告）號: CN102653744A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 遲乃玉;張慶芳;王曉輝;竇少華;于爽;王春雨
• 申請（專利權(quán)）人: 大連大學(xué)
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26
• 代理公司: 大連智慧專利事務(wù)所 21215
• 代理人: 劉琦

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種低溫果膠酶微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。該發(fā)明生產(chǎn)的低溫果膠酶主要應(yīng)用于食品加工、飼料、造紙與紡織、以及其它果膠酶應(yīng)用行業(yè)。可以顯著提高生產(chǎn)率、降低成本、縮短生產(chǎn)周期，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量。

背景技術(shù)

果膠酶(pectinases)是指能協(xié)同分解果膠的一組酶的總稱。主要包括聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠裂解酶(PL)和果膠酯酶(PE)等(裘紀(jì)瑩，中國食品添加劑，2009)。果膠酶作為生物酶制劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、飼料工業(yè)、造紙業(yè)和紡織工業(yè)中，但目前使用的微生物發(fā)酵生產(chǎn)的果膠酶主要為中溫果膠酶。雖然國內(nèi)對果微生物發(fā)酵生產(chǎn)的果膠酶的研究有30多年，但主要是研究中溫果膠酶；有關(guān)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫果膠酶的研究是起步階段，主要是菌種選育和發(fā)酵條件優(yōu)化、生長特性和酶學(xué)性質(zhì)、酶的分離純化以及工程菌構(gòu)建(陳姍姍，廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2007；李祖明，工業(yè)微生物，2008；姜曉雷，中國釀造，2009)。我國微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫果膠酶產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)及應(yīng)用還未見報道。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫果膠酶與高溫、中溫果膠酶相比具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢，因為低溫酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用；在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢；經(jīng)過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會影響產(chǎn)品的品質(zhì)(王偉，食品工業(yè)科技，2011)，這將有助于微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫果膠酶的推廣和使用。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫果膠酶的應(yīng)用將對傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化工、能源和環(huán)保等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。近年來，隨著我國國家政策和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，果汁和果酒行業(yè)得到迅猛發(fā)展。農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)“十一五”發(fā)展規(guī)劃指出：在加工布局上，原料主產(chǎn)區(qū)建立濃縮加工廠，發(fā)展?jié)饪s果蔬汁、果蔬漿等半成品；遼寧、山東、陜西等地發(fā)展?jié)饪s蘋果汁，果膠酶作為果汁加工的重要酶制劑，市場需求量巨大。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫果膠酶將為人類擺脫生存和發(fā)展中所面臨的諸如資源、能源危機(jī)以及環(huán)境污染等困境提供現(xiàn)實(shí)的機(jī)遇。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫果膠酶具有非常廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫果膠酶的方法，該方法主要微生物經(jīng)過低溫馴化后，在10～16℃液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫果膠酶的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫果膠酶粗酶液活性可以達(dá)到200U/mL，如再經(jīng)過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。在飼料中添加500mg/kg果膠酶制劑，能防止果膠類物質(zhì)引起的雛雞生產(chǎn)性能下降，并降低肝脂肪和血清膽固醇的質(zhì)量濃度，顯著提高21日齡肉雞的平均日增質(zhì)量和采食量，并提高飼料的轉(zhuǎn)化率，降低了生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量。該酶制劑應(yīng)用操作簡單、方便、快捷、成本低。可以從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和工藝。

本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫果膠酶的方法具體包括以下步驟：

(1)將產(chǎn)生果膠酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環(huán)境中生長良好；

(2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的果膠酶產(chǎn)生菌在10～16℃逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；

(3)將液體一級種子或二級種子，按發(fā)酵液體積的3～9％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10～16℃培養(yǎng)72～144h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫果膠酶結(jié)束；

(4)將(3)的發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；

(5)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。

本發(fā)明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進(jìn)行。果膠酶產(chǎn)生菌(例如，CGMCC菌種編號：1.229)，菌株先活化、定向馴化后，按本發(fā)明產(chǎn)酶條件發(fā)酵生產(chǎn)低溫果膠酶，低溫馴化后的菌株在4℃環(huán)境中可保存2個月，用10～25％甘油制成的菌懸液、在零下80℃條件下可以長期保藏。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例一：

(1)培養(yǎng)基制備

①菌種活化培養(yǎng)基：蛋白胨15.0g，牛肉膏10.0g，NaCl?10.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸汽滅菌30min。