[發明專利]一種菌絲霉素及其基因和制備方法

有效

• 申請號: 201210109366.3
• 申請日: 2012-04-13
• 公開（公告）號: CN103374579A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 胡又佳;謝麗萍;梁文;張偉;朱寶泉
• 申請（專利權）人: 上海醫藥工業研究院;中國醫藥工業研究總院
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/20;C12R1/19
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;沈利

1.一種菌絲霉素的基因，其特征在于，所述的菌絲霉素的基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?No.1所示。

2.一種菌絲霉素融合蛋白，其特征在于，所述菌絲霉素融合蛋白氨基酸序列依次為保護肽段氨基酸序列，蛋白分離純化標簽氨基酸序列，蛋白酶的酶切位點氨基酸序列以及SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列。

3.如權利要求2所述的菌絲融合蛋白，其特征在于，所述的蛋白分離純化標簽是組氨酸蛋白標簽。

4.如權利要求2所述的菌絲融合蛋白，其特征在于，所述的蛋白酶的酶切位點是TEV酶的酶切位點。

5.如權利要求2所述的菌絲融合蛋白，其特征在于，所述菌絲霉素融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

6.一種菌絲霉素融合蛋白的基因，其特征在于，所述的菌絲霉素融合蛋白的基因是如下(1)或(2)的基因：

(1)其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?No.4所示；

(2)編碼如權利要求2所述的菌絲霉素融合蛋白的基因。

7.一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含如權利要求1所述菌絲霉素的基因或如權利要求6所述菌絲霉素融合蛋白基因。

8.一種重組表達轉化體，其特征在于，該重組表達轉化體包含權利要求1所述的菌絲霉素基因、權利要求6所述的菌絲霉素融合蛋白基因或權利要求7所述的重組表達載體。

9.一種菌絲霉素蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)構建具有如權利要求7所述包含菌絲霉素融合蛋白基因的重組表達載體；將所得的重組表達載體轉化到工程菌種中形成重組表達轉化體，所述工程菌種選自大腸桿菌E.coli?DH5α、E.coli?BL21(DE3)和E.coli?JM109中的一種或幾種；

(2)培養步驟(1)所得的重組表達轉化體表達菌絲霉素融合蛋白，培養基中IPTG濃度為0.05～1.0mmol/L，培養時間為1～6小時，破碎菌體并收集包含菌絲霉素融合蛋白的溶液；

(3)將步驟(2)所得包含菌絲霉素融合蛋白的溶液上樣至親和層析柱，以含有咪唑的洗脫液進行梯度洗脫，咪唑濃度為60mM～300mM，收集含菌絲霉素融合蛋白的洗脫液；

(4)將步驟(3)所得的洗脫液加入TEV酶進行酶切，酶切產物經凝膠過濾進行脫鹽處理；

(5)將步驟(4)所得酶切產物上樣至親和層析柱，以含有咪唑的洗脫液進行梯度洗脫，除去溶液中的保護肽段和TEV酶，收集含有菌絲霉素蛋白的洗脫液；

(6)將步驟(5)所得的含有菌絲霉素蛋白的洗脫液經過反相高效液相色譜層析，以含有乙腈的洗脫液進行梯度洗脫，其中乙腈的體積比含量為20％～80％，收集洗脫液即可。

10.如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述的TEV酶切中TEV酶和菌絲霉素融合蛋白的質量比為0.125∶1～2∶1，酶切溫度為4～37℃，酶切時間為0.5～6小時。