[發(fā)明專利]一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法無效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201210107577.3 | 申請(qǐng)日： | 2012-04-13 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN102628070A | 公開（公告）日： | 2012-08-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 牛洪森;周立慶;左聰;季春香 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 麥科羅夫（南通）生物制藥有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12P21/02 | 分類號(hào)： | C12P21/02;C07K1/22;C12R1/19 |
| 代理公司： | 南京正聯(lián)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32243 | 代理人： | 顧伯興 |
| 地址： | 226000 江蘇省南通市*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 胰島素 表達(dá) 載體 轉(zhuǎn)化 方法 | ||
1.一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：具體步驟為：
A：將含有基因工程甘精胰島素前體的表達(dá)載體質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆菌落接入胰酶大豆肉湯中，在搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度為25-40oC,?轉(zhuǎn)速200-300RPM，培養(yǎng)15-30小時(shí)后，通過離心的方法收集菌體；
B：將第一步離心收集的菌體溶解到10-20?mM?Tris?緩沖液，超聲細(xì)菌裂解，然后將裂解物在4°C、離心力為6000g的條件下離心30-45分鐘，之后收集甘精胰島素融合蛋白包涵體，將其所收集的甘精胰島素融合蛋白包涵體溶解到含6-8?M?脲素的10-20?mM?Tris?緩沖液中，然后向溶液中加入金屬親合樹酯，攪拌混勻，使其結(jié)合甘精胰島素融合蛋白，最后通過離心的方法收集金屬親合樹酯；??
C：將第二步離心收集的金屬親合樹酯，用6-8?M?脲素的10-20mM?Tris?緩沖液沖洗金屬親合樹酯數(shù)次，以去除雜質(zhì)，最后用含有100-200?mM?咪唑和6-8?M?脲素的10-20?mM?Tris?緩沖液將結(jié)合的甘精胰島素融合蛋白洗脫，分別取樣進(jìn)行蛋白電泳檢測胰島素融合蛋白的合成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：此方法中使用的緩沖液的pH值為?8-10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種胰島素前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：所述步驟B中的金屬親合樹酯為鈷離子或鎳離子親合樹酯。
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