[發(fā)明專利]一種對(duì)蝦抗病毒能力測(cè)試的定量、大規(guī)模感染方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210107376.3
• 申請(qǐng)日: 2012-04-13
• 公開（公告）號(hào): CN102630610A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孔杰;張?zhí)鞎r(shí);孟憲紅;羅坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): A01K61/00
• 分類號(hào): A01K61/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于對(duì)蝦抗病良種選育領(lǐng)域，具體地涉及一種對(duì)蝦抗病毒能力測(cè)試的定量、大規(guī)模感染方法。

背景技術(shù)：

對(duì)蝦常見的疾病有白斑綜合病、桃拉病毒病、紅體病和紅腿病等，對(duì)蝦疾病一直困擾著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的恢復(fù)和發(fā)展，在對(duì)蝦抗病良種選育過程中經(jīng)常需要對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，以研究對(duì)蝦對(duì)疾病的抵抗能力，特別是在對(duì)蝦抗病良種選育過程中，需要對(duì)大批量對(duì)蝦進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，記錄對(duì)蝦個(gè)體或家系在攝食帶有病毒的餌料后的存活時(shí)間，以評(píng)判各對(duì)蝦個(gè)體或家系對(duì)該病毒的抵抗力，為抗病良種選育提供有力證據(jù)。但目前對(duì)蝦的人工感染方法，主要有：1)浸浴感染的方法(邱德全等。斑節(jié)對(duì)蝦白斑綜合癥桿狀病毒感染的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑拷Ｑ蟠髮W(xué)學(xué)報(bào)，2001年/第21卷/5期)，浸浴感染時(shí)間長(zhǎng)，感染過程中受影響的因素較多，一般認(rèn)為實(shí)驗(yàn)蝦沒有影響，在抗病選育中沒有采用。2)人工注射的方法(謝數(shù)濤等.斑節(jié)對(duì)蝦白斑癥的發(fā)病歷程，暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)/2000年/第21卷/第5期)，但此感染的方法是用注射器注射入蝦體內(nèi)病毒液，感染操作繁瑣，技術(shù)要求高。一方面，此方法與對(duì)蝦自然感染的方式不符，無法反映對(duì)蝦自然感染情況下的抗病；另一方面，對(duì)蝦蝦體較小，通過注射的方式難免對(duì)蝦體造成傷害，由此可能引起蝦染病而死還是由于外傷感染而死的疑問。3)混養(yǎng)后粗放式投喂毒餌的方法(劉凱于等.對(duì)蝦白斑癥病毒的初步研究，華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)/2000年/第34卷/第3期)。此方法采用所有實(shí)驗(yàn)個(gè)體混養(yǎng)在養(yǎng)殖池中，暫養(yǎng)并停止投喂1-3天后，向養(yǎng)殖池內(nèi)投入含有病毒的飼料顆粒，并記錄投喂時(shí)間，以此時(shí)間點(diǎn)為計(jì)算對(duì)蝦個(gè)體存活時(shí)間的起點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖池內(nèi)有死亡對(duì)蝦立即撈出，記錄死亡時(shí)間。由于中國(guó)對(duì)蝦具有同類蠶食的特點(diǎn)，這種混養(yǎng)后粗放式投喂毒餌的方法在停食期間，體弱、蛻皮的對(duì)蝦可能會(huì)被其他同類吃掉而丟失有關(guān)信息；另外，全池投喂的結(jié)果不能保證每尾對(duì)蝦均攝食(蝦蛻皮時(shí)不攝食，已蠶食同類而飽胃的蝦也可能不攝食毒餌)，也不能保證每尾對(duì)蝦僅攝食一次，因此無法判斷對(duì)蝦在實(shí)驗(yàn)期間是由于攝食毒餌后死亡還是由于養(yǎng)殖環(huán)境中的其它環(huán)境因子導(dǎo)致其死亡，以致不能為抗病良種選育提供準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)信息。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種對(duì)蝦抗病毒能力測(cè)試的定量、大規(guī)模感染方法，杜絕對(duì)蝦蠶食同類、避免過量感染，以解決目前對(duì)蝦抗病力測(cè)試過程中因注射、粗放式投喂等原因造成外傷、同類蠶食、過量感染等缺陷，確保為抗病優(yōu)良良種選育提供完整而且準(zhǔn)確的信息。

本發(fā)明是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種對(duì)蝦抗病毒能力測(cè)試的定量、大規(guī)模感染方法，具體包括以下步驟：

1)、感染前的準(zhǔn)備選取體質(zhì)健康、規(guī)格整齊，體長(zhǎng)2.0-2.5cm的各家系對(duì)蝦為測(cè)試個(gè)體，每個(gè)對(duì)蝦都具有標(biāo)示，水溫為正常養(yǎng)殖期水溫，按常規(guī)操作正常投喂、換水；

2)、感染源制備病源為-80℃保存的自然感染待測(cè)病毒發(fā)病的對(duì)蝦。取病蝦的鰓，剪碎后按約1g鰓組織：15mL溶液的比例，加入緩沖液，緩沖液的成份為：20mmol/L?Tris-HCl，0.4mol/L?NaCl，10mmol/L?EDT?A，pH7.5，用勻漿機(jī)攪打，制備成勻漿液，用雙層紗布擠壓過濾去粗渣，再在4℃，8000r/min離心15min去沉淀，上清液再在4℃，15000r/min離心40min，棄去上清液，沉淀加8倍體積的上述緩沖液溶解，即得待測(cè)病毒懸液，用無菌生理鹽水以1∶200體積稀釋待測(cè)病毒懸液，注射感染經(jīng)PCR檢驗(yàn)后的健康對(duì)蝦，每尾對(duì)蝦注射200L，確認(rèn)已感染待測(cè)病毒后，取對(duì)蝦的鰓和肌肉，用勻漿機(jī)攪勻打碎，制成適合感染對(duì)蝦口徑的均勻顆粒；

3)、逐尾感染將待測(cè)試對(duì)蝦分別置于透明塑料容器中，塑料容器底部鋪設(shè)黑色背景以便于觀察，饑餓2小時(shí)后，將毒餌投入容器中，觀察對(duì)蝦攝食情況；

4)、數(shù)據(jù)采集及分析感染結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)用對(duì)蝦全部轉(zhuǎn)入同一大型混養(yǎng)池中，正常投餌、換水，觀察對(duì)蝦死亡情況，從第一尾對(duì)蝦死亡開始記錄對(duì)蝦死亡時(shí)間、體長(zhǎng)、體重及家系編號(hào)；死亡高峰時(shí)，每個(gè)小時(shí)吸池底一次，并收集死蝦置-80℃保存，實(shí)驗(yàn)廢水施用50ppm有效氯消毒處理后排放，嚴(yán)格操作，以免病毒擴(kuò)散，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，選擇存活率較高的家系的備份留種，感染實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)期存活的對(duì)蝦同時(shí)作為抗病良種轉(zhuǎn)移到新池中培育。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：