[發明專利]抗甲魚系統性敗血癥球狀病毒的卵黃抗體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210107121.7
• 申請日: 2012-04-13
• 公開（公告）號: CN103073640A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 李登峰;周永強;劉聯國;彭嬌;陳炯
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/02;A61K39/42;A61P31/14;A23L1/29;A23K1/16;G01N33/569
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.一種抗甲魚系統性敗血癥球狀病毒的卵黃抗體，其特征在于：采用甲魚系統性敗血癥球狀病毒為抗原免疫產蛋母雞，從免疫雞蛋卵黃中提取得到所述的抗甲魚系統性敗血癥球狀病毒的雞卵黃抗體粗提物，純化后得到抗甲魚系統性敗血癥球狀病毒的卵黃抗體純品。

2.一種權利要求1所述的抗甲魚系統性敗血癥球狀病毒的卵黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）抗原制備

????選取患病甲魚，取甲魚內臟置于預先冰浴過的TNE緩沖液中，勻漿直至完全碎裂，將勻漿液在4℃，6000g條件下離心10min后，取上清液在4℃?，8000g條件下離心20min，取再次離心所得上清液于4℃，35000g離心1.5h后獲取一次沉淀物，將一次沉淀物的沉淀上層疏松部分用TM緩沖液小心沖洗掉，沉淀下層白色部分重懸于1ml的TM緩沖液中，4℃冰浴過夜；次日將過夜處理的沉淀重新懸浮起來，4℃下3500g條件下離心5min后，取上清液于4℃，38000g條件下離心1.5h獲取二次沉淀物，將二次沉淀物的沉淀上層疏松部分小心去掉后，下層白色沉淀用少量TM緩沖液重懸后制成病毒懸浮液，即為甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原；

???（2）動物免疫

將蛋雞進行1次基礎免疫和2～3次加強免疫，所述的基礎免疫為在步驟（1）得到的甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，充分乳化后對蛋雞進行注射免疫，所述的加強免疫為在步驟（1）得到的甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐劑，充分乳化后對蛋雞進行注射免疫，注射用量為每千克母雞注射500mg甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原，每次免疫間隔時間為15天，完成免疫后10天，開始收集雞蛋，于4℃冰箱保存；

???（3）特異卵黃抗體的分離和純化

將步驟（2）得到的免疫雞蛋用酒精擦拭蛋殼并分離卵黃，吸取卵黃液，然后在卵黃液中加入卵黃液10倍體積的0.05?M的?pH?為5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，混勻后于4?℃冰箱靜置過夜處理，將過夜處理后的混合液于4?℃，10000g的條件下離心20?min后取上清液，在上清液中加入飽和的（NH₄）₂SO₄使其終濃度為40%，4?℃靜置10h，再10000g離心20?min后取沉淀，將沉淀用140g/L的Na₂SO₄稀釋至100?ml，再次于4℃靜置10?h后，10000?g離心20?min，沉淀用0.01M?的pH?為7.2?的PBS重懸，最后用截留量為100KD的透析袋透析除鹽得到甲魚系統性敗血癥球狀病毒卵黃抗體。

3.根據權利要求2所述的抗甲魚系統性敗血癥球狀病毒的卵黃抗體的制備方法，其特征在于步驟（1）中所述的TNE緩沖液的pH為7.5，配制終濃度如下：50?mM?Tris-HCl，200?mM?NaCl，5mM乙二胺四乙酸，1mM?苯甲基磺酰氟。

4.根據權利要求2所述的抗甲魚系統性敗血癥球狀病毒的卵黃抗體的制備方法，其特征在于步驟（1）中所述的TM緩沖液的pH為7.5，配制終濃度如下：50?mM?Tris-HCl，10?mM?MgCl_2?，1mM?苯甲基磺酰氟。

5.一種權利要求1所述的抗甲魚系統性敗血癥球狀病毒的卵黃抗體的應用，其特征在于應用于制備預防和治療因甲魚系統性敗血癥球狀病毒引起的相關疾病的藥物、保健品或飼料添加劑，并可用于開發甲魚系統性敗血癥球狀病毒檢測試劑盒和免疫學上的免疫反應及診斷。