[發(fā)明專利]微生物中酶活性的誘導(dǎo)和穩(wěn)定

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210105416.0
• 申請日: 2007-01-30
• 公開（公告）號: CN102634504A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喬治·E·皮爾斯;吉恩·德拉戈;桑熱塔·甘谷利
• 申請（專利權(quán)）人: 佐治亞州立大學(xué)研究基金會
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/08;C12N1/20;C12R1/01;C12R1/13;C12R1/38;C12R1/365
• 代理公司: 北京三友知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11127
• 代理人: 丁香蘭

本申請是分案申請，其原申請的國際申請?zhí)枮镻CT/US2007/061315，中國國家申請?zhí)枮?00780011311.6，申請日為2007年1月30日，發(fā)明名稱為“微生物中酶活性的誘導(dǎo)和穩(wěn)定”。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明主要涉及培育用于酶產(chǎn)生的微生物的方法和包含具有經(jīng)誘導(dǎo)和/或穩(wěn)定的活性的酶或微生物的組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及通過使用特定的生長培養(yǎng)基來誘導(dǎo)微生物中所需酶活性的方法，以及涉及在酶或能產(chǎn)生所述酶的微生物內(nèi)穩(wěn)定所需活性的方法。

背景技術(shù)

長期以來，微生物及其酶在各種產(chǎn)品的制備中用作生物催化劑。酵母在糖至醇的發(fā)酵中的作用是立即可以想到的例子。近年來，對微生物及其酶在通常被認(rèn)為是不符合酶用途的商業(yè)活動中的應(yīng)用的興趣日益增長。一個(gè)例子是微生物在工業(yè)加工，尤其是在廢物處理中的應(yīng)用。

含腈化合物廣泛用于各種商業(yè)應(yīng)用。例如，腈用在許多具有商業(yè)用途的化合物的合成中，所述化合物包括胺、酰胺、脒、羧酸、酯、醛、酮、亞胺和雜環(huán)化合物。腈也可用作溶劑、除草劑，以及用在去污劑和防腐劑的合成中。一種商業(yè)上更重要的腈是丙烯腈，其用在丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸纖維、共聚物樹脂和腈橡膠的生產(chǎn)中。

在腈的生產(chǎn)中產(chǎn)生的廢物流經(jīng)常含有高濃度的危險(xiǎn)性含氮化合物。例如，所述廢物流可含有腈，諸如乙腈、丙烯腈、琥珀腈和富馬腈。此外，這樣的廢物流還可含有危險(xiǎn)性化合物，如氰化物、丙烯酰胺、丙烯醛和氰醇。由于危險(xiǎn)性廢物通常不能合法地排放到環(huán)境中，因此在商業(yè)生產(chǎn)過程中，處理廢物流以除去或治理一種或多種危險(xiǎn)性組分的方法是重要的。

已完成一種用于處理氮廢物流的方法，其采用某些微生物將腈化合物轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的酰胺或酸。例如美國專利號3,940,316和美國專利號4,001,081公開了使用腈水合酶微生物由丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺。

通常，腈轉(zhuǎn)化微生物在涉及腈水合酶和酰胺酶的兩步反應(yīng)中降解脂肪族腈。在第一步中，腈水合酶催化所述腈(或氰醇)水解為相應(yīng)的酰胺(或羥基酸)。在第二步中，酰胺酶催化所述酰胺水解為相應(yīng)的酸或羥基酸。相似的是，一些微生物已顯示出通過腈水解酶的作用直接將芳香族腈轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的酸從而降解這些腈。

由于起初的報(bào)道證明了丙烯腈轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺的生物轉(zhuǎn)化的潛在商業(yè)用途，因此，在所述腈的微生物降解中所涉及的酶已受到顯著關(guān)注。手性酸的酶法制備(諸如由氰醇前體得到羥基酸)的可能性也已成為該領(lǐng)域內(nèi)頗受關(guān)注的焦點(diǎn)。盡管有很有前景的結(jié)果，但是以上討論的腈水合酶/酰胺酶轉(zhuǎn)化的多種潛在應(yīng)用依然未得到完全開發(fā)。

微生物及其酶的日益增加的用途的另一個(gè)例子是天冬氨酸的形成。天冬酰胺酶I是催化天冬酰胺水解為天冬氨酸的酶，如下所示：

HOOCCHNH₂CONH₂+H₂O→HOOCCHNH₂CH₂COOH+NH₃

天冬酰胺酶I可在細(xì)菌、植物和很多動物中找到；然而由于人白細(xì)胞不具有所必需的天冬酰胺合成酶，所以所述細(xì)胞不能生成天冬酰胺。因此已發(fā)現(xiàn)天冬酰胺酶I可有效治療人惡性白血病。白血病細(xì)胞通常具有低水平的天冬酰胺合成酶，所述酶有時(shí)候完全缺失。因此，白血病細(xì)胞通常需要外界來源的天冬酰胺。由于天冬酰胺酶I將天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸，因此向患有白血病的患者施用天冬酰胺酶I進(jìn)一步限制了所述癌細(xì)胞的天冬酰胺的可供來源，并且起到使得所述細(xì)胞變?nèi)醯淖饔茫蛊涓菀资艿交煹挠绊憽Ｒ虼耍ǔＷ鳛槁?lián)合療法的一部分與化療劑一起向白血病患者施用天冬酰胺酶I。

在這樣的治療中所使用的天冬酰胺酶I目前獲自大腸桿菌(E.coli)(以異四聚體的形式)和歐文氏菌(Erwinia)(以同四聚體的形式)，但這些來源各自具有缺點(diǎn)。例如，獲自大腸桿菌的天冬酰胺酶I不如獲自歐文氏菌的天冬酰胺酶I有效。然而，與使用大腸桿菌相比，使用歐文氏菌產(chǎn)生天冬酰胺酶I更加困難。此外，這些來源可導(dǎo)致在所分離的酶中存在不利的革蘭氏陰性毒素。因此，存在以下需求，即由各種微生物提高天冬酰胺酶I的產(chǎn)生，并避免同時(shí)產(chǎn)生有害的革蘭氏陰性毒素。

穩(wěn)定性，是實(shí)用性生物催化劑的關(guān)鍵因素，已成為在許多商業(yè)應(yīng)用中使用腈水合酶和/或酰胺酶的重要障礙。雖然固定和化學(xué)穩(wěn)定劑是公認(rèn)的提高酶穩(wěn)定性的方法，但目前的固定和穩(wěn)定技術(shù)仍需要進(jìn)一步的發(fā)展。因此，在本領(lǐng)域中仍存在對在各種微生物中，尤其是在能產(chǎn)生在含腈化合物的降解中有用的酶的微生物中，誘導(dǎo)高水平的酶活性的方法的需求。此外，還存在對提高含腈化合物降解中的關(guān)鍵酶的穩(wěn)定性的方法的需求。