[發(fā)明專利]一種檢測(cè)纖維二糖脫氫酶活性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210102860.7
• 申請(qǐng)日: 2012-04-10
• 公開（公告）號(hào): CN102618622A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賴萃;曾茁桐;曾光明;黃丹蓮;趙美花;危臻;黃超;李寧杰;許飄;張辰;李芳玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/32
• 分類號(hào): C12Q1/32;G01N21/55
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務(wù)所 43008
• 代理人: 趙洪;楊斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域中測(cè)定酶活性的方法，尤其涉及一種檢測(cè)纖維二糖脫氫酶活性的方法。

背景技術(shù)

纖維二糖脫氫酶（Cellobiose?Dehydrogenase，CDH）是一種雙輔助因子的黃素血紅素蛋白。CDH是很多木質(zhì)纖維素降解真菌在纖維素降解條件下產(chǎn)生的細(xì)胞外酶，它可以氧化纖維二糖和纖維寡糖生成相應(yīng)的內(nèi)酯，同時(shí)利用糖所衍生的電子還原醌、苯氧自由基等。CDH具有較寬的底物范圍，在以纖維二糖為電子供體時(shí)，可以還原多種電子受體，如醌、細(xì)胞色素c、三碘離子，F(xiàn)e³⁺及O₂等。CDH被認(rèn)為可以通過還原Fe³⁺和O₂生成Fenton試劑來氧化降解纖維素，同時(shí)由于CDH還可以還原木質(zhì)素相關(guān)的醌和苯氧自由基，從而可以阻止木質(zhì)素降解酶在氧化木質(zhì)素時(shí)生成的自由基的再聚合反應(yīng)。因此CDH被認(rèn)為是連接纖維素降解和木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶，在木質(zhì)素降解中起重要作用。

纖維二糖脫氫酶的研究日益受到重視，不僅因?yàn)樵撁釜?dú)特的性能及結(jié)構(gòu)，更在于它在木質(zhì)素降解方面的大規(guī)模應(yīng)用前景。然而目前研究較多的產(chǎn)CDH的黃孢原毛平革菌（Phanerochaete?chrysosporium）產(chǎn)量較低，限制了其應(yīng)用。因此，菌種產(chǎn)酶條件的優(yōu)化研究成為熱點(diǎn)，而建立一種能快速、靈敏地檢測(cè)CDH活性的方法不僅能協(xié)助菌種產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，還能進(jìn)一步拓寬該酶的應(yīng)用范圍。

目前，對(duì)于CDH活性的檢測(cè)普遍采用測(cè)定CDH對(duì)3,5-二叔丁基-1,4-苯醌或者對(duì)2,6-二氯吲哚酚鈉（DCIP）的還原消耗。而許多產(chǎn)CDH的木素降解菌會(huì)同時(shí)產(chǎn)其它木素降解酶而影響對(duì)CDH活性的檢測(cè)，例如漆酶（Laccase）的存在會(huì)重新氧化DCIP被CDH還原后的產(chǎn)物，從而降低了CDH活性的檢測(cè)精確度。此外，其它被報(bào)道的CDH活性的檢測(cè)方法（如細(xì)胞色素c還原法）的檢測(cè)精確度也受上述因素干擾。據(jù)此，研究一種能克服其它堆肥功能酶干擾的纖維二糖脫氫酶活性檢測(cè)方法是本領(lǐng)域亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種靈敏度更高、抗干擾能力更強(qiáng)的檢測(cè)纖維二糖脫氫酶活性的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種檢測(cè)纖維二糖脫氫酶活性的方法，包括以下步驟：

（1）納米金顆粒的制備：取HAuCl₄水溶液加熱攪拌至沸騰，然后邊攪拌邊加入檸檬酸鈉溶液，直至混合溶液顏色轉(zhuǎn)為清亮橘紅色后停止加熱，繼續(xù)攪拌，室溫冷卻，得含納米金顆粒的溶液；

（2）檢測(cè)體系的制備：將上述含納米金顆粒的溶液加入到緩沖溶液中（該緩沖液優(yōu)選為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液），再加入纖維二糖溶液、氯金酸溶液和表面活性劑溶液，調(diào)節(jié)混合溶液中各組分的濃度，使所述納米金顆粒、纖維二糖在混合溶液中的濃度分別控制在0.3nM～0.4nM和0.4mM～0.5mM（氯金酸和表面活性劑的濃度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際情況在較大范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整，無特別要求，但氯金酸的濃度優(yōu)選為0.2mM，表面活性劑的濃度優(yōu)選為2mM），配得檢測(cè)體系；

（3）酶活測(cè)定：將待測(cè)溶液按照1∶（4.5～5.5）的體積比添加到所述的檢測(cè)體系中，混合均勻，待充分反應(yīng)完全后，用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)后的產(chǎn)物體系進(jìn)行光譜掃描，測(cè)得產(chǎn)物體系中納米金顆粒的表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度，再根據(jù)測(cè)得的表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度數(shù)值和已經(jīng)建立的線性回歸方程，得到待測(cè)溶液中纖維二糖脫氫酶的酶活。

上述檢測(cè)纖維二糖脫氫酶活性的方法，所述檢測(cè)體系中，所述纖維二糖、氯金酸和納米金的摩爾比優(yōu)選為（2～2.5）∶1∶（1.5×10^-6～2×10^-6）。一般而言，檢測(cè)體系中所述（檸檬酸-檸檬酸鈉）緩沖溶液濃度優(yōu)選為0.1mol/L。

上述檢測(cè)纖維二糖脫氫酶活性的方法，所述酶活測(cè)定步驟中，所述反應(yīng)的測(cè)定條件優(yōu)選為：反應(yīng)溫度控制在30℃～37℃，反應(yīng)pH值為4.5～5.0，反應(yīng)時(shí)間為10min～15min。

上述檢測(cè)纖維二糖脫氫酶活性的方法，所述表面活性劑優(yōu)選為十六烷基三甲基氯化銨（簡(jiǎn)稱，CTAC）。

上述檢測(cè)纖維二糖脫氫酶活性的方法優(yōu)選應(yīng)用于檢測(cè)黃孢原毛平革菌培養(yǎng)后產(chǎn)出的粗酶液，即所述待測(cè)溶液優(yōu)選為黃孢原毛平革菌培養(yǎng)后產(chǎn)出的粗酶液。