[發明專利]用BsrI鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976的試劑盒

有效

• 申請號: 201210091429.7
• 申請日: 2009-12-24
• 公開（公告）號: CN102660638A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 姚武;王威;楊永利
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京智匯東方知識產權代理事務所(普通合伙) 11391
• 代理人: 張群峰;康正德

本申請是申請號為“200910227637.3”、申請日為2009年12月24日、發明名稱為“鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976的方法”的發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及鑒定單核苷酸多態性的方法。更具體地，本發明涉及鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976的方法。

背景技術

SNP(單核苷酸多態性)是指單個核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基的置換、插入和缺失等形式。SNP現已廣泛用于簡單和復雜疾病的遺傳連鎖分析、關聯分析及疾病易感基因的定位，指導易感基因克隆。聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態(PCR-RFLP)技術是一種快速、簡便、準確、低成本檢測SNP基因型的經典方法。該方法原理是：限制性內切酶是一類識別DNA特異位點(通常4～6bp)，并在特異位點進行切割的酶類。酶切位點的特異性意味著對特定DNA等位基因的完全消化會產生同樣的片段序列。而堿基的替換或插入、缺失可以產生或消除一個特定酶切位點，從而改變酶切割后產生片段的大小和數目。這些酶切片段帶型的不同稱為限制性片段長度多態性。如果SNP產生和消除了某個限制性內切酶位點，則可以通過對PCR產物進行酶切、電泳加以檢測。該方法主要優點在于操作簡便，快速，終點判斷準確。主要缺點在于酶切位點的選擇，并不是所有的SNP位點都可以使用該方法來鑒別，且部分內切酶價格昂貴。

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate?reductase，MTHFR)是一種重要的葉酸代謝酶，體內催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為體內最主要的甲基供體5-甲基四氫葉酸，具有重要的生理功能。目前研究發現編碼該蛋白的基因缺陷與動脈硬化性血管阻塞性疾病密切相關，還是胎兒神經管畸形及癌癥發生的遺傳因素。人MTHFR基因定位于染色體1P36.3，該基因第十二外顯子A/G堿基變異可引起第594位氨基酸變異(Gln/Arg)，文獻中常記為1793A/G多態，該多態可能影響MTHFR的功能。美國國立衛生研究院國立醫學圖書館生物信息技術中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)可查閱MTHFR基因及其多態序列和相關信息，該多態在SNP數據庫中編號為rs2274976。因此，通常該多態在人群中存在三種MTHFR基因的基因型：GG型(人體基因組rs2274976多態位點的兩個等位基因堿基均為G)，AG型(人體基因組rs2274976多態位點的兩個等位基因堿基分別為G和A)和AA型(人體基因組rs2274976多態位點的兩個等位基因堿基均為A)。

目前人MTHFR基因多態rs2274976的鑒定常采用PCR-RFLP方法。目前鑒定人MTHFR基因多態rs2274976時常使用內切酶BsrBI進行鑒定，該內切酶的價格昂貴(關于部分內切酶的參考價格可以參考后面的表1)，影響了實驗的費用，難以在實驗室中普及使用。并且由于傳統PCR-RFLP方法的固有缺陷，本領域技術人員通常難以選擇其他限制性內切酶對人MTHFR基因多態rs2274976進行鑒定。

因此，本領域存在對操作簡單，成本低，使用范圍廣的新型檢測SNP的方法的需求。

發明內容

本發明提供了一種操作簡單，成本低，使用范圍廣的鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976的方法，其包括以下步驟：

a)提供待測人基因組DNA；

b)使用擴增人MTHFR基因多態性rs2274976位點附近序列的正向引物和反向引物，以所述待測人基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應，獲得擴增產物；

c)使用限制性內切酶對所述擴增產物進行酶切，獲得酶切產物；以及

d)對所述酶切產物進行電泳，以鑒定人MTHFR基因多態性rs2274976，其中，所述正向引物其3’末端倒數第一位堿基與多態rs2274976堿基相鄰，倒數第二位堿基為錯配堿基C，以便在擴增產物中與多態G等位基因形成CCGG(第一個堿基C為錯配堿基，第三個堿基G為多態等位基因)或ACCGGT(第二個堿基C為錯配堿基，第四個堿基G為多態等位基因)結構，或者與多態A等位基因形成CCAGT(第一個堿基C為錯配堿基，第三個堿基A為多態等位基因)結構。