[發(fā)明專利]微量游離mRNA提取和富集方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210083189.6
• 申請日: 2012-03-26
• 公開（公告）號(hào): CN102676500A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉寶瑞;沈潔;魏嘉
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 南京中新達(dá)專利代理有限公司 32226
• 代理人: 孫鷗;朱杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)提取方法，特別涉及微量游離mRNA提取和富集方法。

背景技術(shù)

近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血漿中的游離mRNA(cell-free?mRNA)蘊(yùn)含豐富的腫瘤信息，如CK19mRNA若在血清/血漿中檢出，可提示血中存在腫瘤細(xì)胞或已經(jīng)發(fā)生了臨床影像學(xué)難以發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移；結(jié)腸癌患者腫瘤組織與血漿hTERT-AT?mRNA表達(dá)水平呈顯著相關(guān)，且均能夠反映病情進(jìn)展的程度，提示游離mRNA能夠客觀反映腫瘤信息；乳腺癌患者血漿游離CyclinD1和TS?mRNA表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后及藥物治療療效相關(guān)。血漿游離核酸的發(fā)現(xiàn)與檢測為腫瘤的早期診斷、實(shí)時(shí)監(jiān)控及實(shí)時(shí)個(gè)體化藥物治療提供了新的檢測來源。

但是，由于血漿中大量RNA酶的存在，血漿游離mRNA非常容易發(fā)生降解，且由于血液的稀釋作用，因此，每毫升血漿游離mRNA的量非常少(＜1ug)。

在本發(fā)明之前，基于以上兩個(gè)主要原因，血漿游離mRNA的檢測存在檢出率很低，標(biāo)本量需求大，重復(fù)性差等問題。因而，急需建立具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的敏感性高、特異性高、重復(fù)性好的微量游離mRNA抽提、富集與定量檢測技術(shù)，來達(dá)到對血液或其他液體中所含的微量游離mRNA的檢測，以滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就在于解決上述問題，研制一種微量游離mRNA提取和富集方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

微量游離mRNA提取和富集方法，其主要技術(shù)步驟在于：

(1)抽取含微量游離mRNA的液體，兩次離心，獲取上清；

(2)取上清加入到Trizol?LS溶液中，室溫震蕩；

(3)向其中加入氯仿，劇烈震蕩；

(4)離心，吸取水相層至新管；

(5)加入70％乙醇，混勻；將含有乙醇和RNA的液體轉(zhuǎn)移到帶有濾網(wǎng)的收集管中，離心；

(6)洗滌濾網(wǎng)和濾網(wǎng)上的RNA；

(7)離心，干燥濾網(wǎng)和RNA；

(8)加無RNA酶水溶解RNA，離心；

(9)加入DNA酶；

(10)終止DNA酶反應(yīng)，離心，獲得最終富集并純化的RNA，以其為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于發(fā)明了一種從少量液體(750ul)中抽提和富集微量(＜1ug)游離mRNA的方法，實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增證實(shí)相關(guān)目的基因的表達(dá)，并且顯著提高了微量游離mRNA的檢出率。本發(fā)明可從少量(750ul)血漿標(biāo)本中擴(kuò)增腫瘤相關(guān)基因，可從少量(750ul)血漿標(biāo)本中擴(kuò)增化療相關(guān)基因，操作方便，靈敏度高，特異性強(qiáng)，可重復(fù)性強(qiáng)。具體而言：

1.突破了傳統(tǒng)上從腫瘤組織或者腫瘤細(xì)胞中提取RNA的方法，開創(chuàng)性地成功從少量液體中抽提、富集并定量檢測了微量游離mRNA；

2.可從少量(750ul)血漿標(biāo)本中擴(kuò)增腫瘤特異性表達(dá)基因；

3.可從少量(750ul)血漿標(biāo)本中擴(kuò)增相關(guān)腫瘤標(biāo)記物，如CEA，CA199，CA125等；

4.可從少量(750ul)血漿標(biāo)本中擴(kuò)增化療相關(guān)基因(如BRCA1、ERCC1、hENT1、RRM1、TS、Topo1、APTX等)；

5.與目前已報(bào)道的游離mRNA檢測方法相比(目前文獻(xiàn)所報(bào)道的mRNA提取方法大多基于RNA沉淀技術(shù)或者是磁珠富集技術(shù))，本方法檢出率高，靈敏度高，重復(fù)性強(qiáng)，特異性強(qiáng)，成本低，操作簡便，省時(shí)省力；

6.與從腫瘤組織相關(guān)基因的mRNA定量檢測方法相比，本方法具有“實(shí)時(shí)”的巨大優(yōu)點(diǎn)，且該方法靈敏度高，操作簡便，省時(shí)省力；

7.與循環(huán)腫瘤細(xì)胞中相關(guān)基因的mRNA定量檢測方法相比，本方法無需繁瑣而復(fù)雜的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離、富集、裂解等步驟，且檢出率高，靈敏度高，重復(fù)性強(qiáng)，操作簡便，省時(shí)省力。

附圖說明

圖1——部分血漿標(biāo)本游離BRCA1、ERCC1、hENT1、RRM1、TS、Topo1和APTXmRNA的擴(kuò)增示意圖。

圖2——BRCA1、ERCC1、hENT1、RRM1、TS、Topo1和APTX?mRNA在血漿的表達(dá)水平及檢出率對比示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的技術(shù)步驟如下：

(1)所有物品均經(jīng)去RNA酶處理；

(2)將2ml血液加入0.5ml?3.8％枸櫞酸鈉溶液的無RNA酶管中；

(3)3000g，4℃離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新管；