[發(fā)明專利]一種視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210068790.8
• 申請日: 2012-03-15
• 公開（公告）號: CN102618489A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉勇;陰正勤;曾玉曉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/073
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 謝殿武

1.一種視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于：包括如下步驟：

a.提供視網(wǎng)膜；

b.從步驟a中所述視網(wǎng)膜中分離出神經(jīng)上皮組織；

c.消化分離步驟b中的神經(jīng)上皮組織并制成細(xì)胞懸液；

d.將步驟c中的細(xì)胞懸液采用差速貼壁分離出視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞；

e.低氧培養(yǎng)步驟d中視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟a中所述視網(wǎng)膜為人胚胎視網(wǎng)膜。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于：所述人胚胎視網(wǎng)膜為12-16周的胚胎的視網(wǎng)膜。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟b中所述神經(jīng)上皮組織分離后剪碎并用無鈣鎂液清洗。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟c中所述消化分離采用的方法包括：用1U/ml木瓜蛋白酶+0.02％EDTA的消化液于37℃消化10-30分鐘；加入含DNase?I的NB培養(yǎng)基稀釋消化液，輕輕晃動10秒并靜置2分鐘澄清，棄上清；加入NB培養(yǎng)基，搖勻并靜置澄清，收集上清并以轉(zhuǎn)速2400g離心5分鐘；棄離心后的上清，得細(xì)胞沉淀；所述細(xì)胞懸液通過向所述細(xì)胞沉淀中加入B27的NB培養(yǎng)基制成。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟d中所述差速貼壁采用的方法包括：將所述細(xì)胞懸液接種于鋪有基質(zhì)膠的培養(yǎng)器皿，37℃培養(yǎng)2小時；收集未貼壁細(xì)胞接種普通培養(yǎng)器皿。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的視網(wǎng)膜感光前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟e中所述低氧培養(yǎng)是在37℃，5％O₂和5％CO₂的環(huán)境中進(jìn)行。