[發明專利]用于生產脂肪酶的方法、能產生所述脂肪酶的轉化解脂耶氏酵母細胞以及它們的應用

有效

• 申請號: 201210067382.0
• 申請日: 2006-06-15
• 公開（公告）號: CN102703404A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 伊夫·勒布隆;尼古拉斯·穆茲;阿蘭·馬蒂;讓·路易·烏里韋拉雷亞
• 申請（專利權）人: 法國米奧里大藥廠
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N1/19;C12R1/645
• 代理公司: 上海市華誠律師事務所 31210
• 代理人: 傅強國;賈師英

本申請是申請日為2006年6月15日、申請號為200680054940.2(PCT/FR2006/001352)的發明專利申請的分案申請。?

技術領域

本發明涉及一種通過使用產生耐酸的重組體脂肪酶的解脂耶氏酵母(Yarrowia?lipolytica)細胞來生產脂肪酶的方法，該方法允許生產能用作藥物的脂肪酶；本發明還涉及一種過度產生耐酸重組體脂肪酶的解脂耶氏酵母菌株及其應用。?

背景技術

人類每日攝取的食品主要由脂類、蛋白質和糖組成。在它們被吸收之前，所有這些組成要經受消化道內的酶的催化水解。這些酶中任何一種的缺乏可以因此引起消化紊亂，并且導致相當嚴重的營養不良。即，例如，在一些病態情況的病例中，比如囊性纖維化或外分泌胰腺的不足與胰脂酶缺乏有關。為校正這些缺乏，通常建議口服給藥胰腺提取物。然而，這些療法的效率受限于如下事實：這些提取物中所含的酶(脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶)會因胃介質的酸性而快速失活。?

因此，有人建議使用抗胃環境的脂肪酶制劑，比如，其例子有通過基因工程生產的哺乳動物胃脂肪酶制劑，比如申請人為于文尼爾研究股份公司(INSTITUT?DE?RECHERCHE?JOUVENIAL?SA)的法國專利申請公開2699179描述的制劑、或者在酸性介質中具有適當活性的微生物脂肪酶制劑[ZENTLER-MONRO等，Pancreas，7，311-319(1992)]。?

在酸性介質中有活性的微生物脂肪酶中，可能會尤其提到真菌脂肪酶，比如來自歐諾比假絲酵母(Candida?ernobii)[YOSHIDA等，Biochim.Biophys.Acta.；154，586-588(1968)]、來自星狀絲孢酵母(Trichosporon?asteroid)[DHARMSTHITI等，Biotechnol.Appl.Biochem.，26，111-116(1997)]、來自爪哇根霉(Rhizopus?javanicus)[UYTTENBROECK等，Biol.Chem.Hoppe?Seyler，374，245-254，(1993)]、或來自解脂耶氏酵母[HADEBALL，Acta?Biotechnol.，2，159-167(1991)；NOVOTNY等，J.Basic?Microbiol.28，221-227(1988)]的那些真菌脂肪酶。除了它們在酸性pH下的活性之外，這些脂肪酶當它們的底物存在時，具有通常的抗蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶)消化的特性，并且具有抵抗膽鹽作用的特性(當存在10mM牛磺膽酸鈉時它們的活性可保持)。?

已經有人描述了解脂耶氏酵母用于生產所研究基因的應用。因此，申請人為INRA和?CNRS的專利申請EP?1108043描述了包含所研究基因的表達盒和Zeta序列(zeta?sequences)的整合載體的應用，該整合載體對應于解脂耶氏酵母Ylt逆轉錄轉座子的LTR序列。這樣的表達載體允許將插入所研究基因的數個拷貝非同源地并且分散地整合入缺乏Zeta序列的解脂耶氏酵母菌株的基因組DNA中。該系統尤其已經用于將編碼脂肪酶的LIP2基因整合入解脂耶氏酵母DNA，并且已經允許在培養基條件(未詳述)下，與未轉化的菌株相比，轉化菌株分泌的脂肪酶量高出10至15倍。?

其他研究描述了如專利申請EP?1108043所述的相同表達載體用于在解脂耶氏酵母中產生重組體脂肪酶的應用(國際申請WO?01/83773；PIGNEDE等，Journal?of?Bacteriology，vol.182，No.10，p.2802-2810(2000)以及PIGNEDE等，Applied?and?Environmental?Microbiology，vol.66，No.8，p.3283-3289(2000))。具體為：?