[發(fā)明專利]一種雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)O1群和O139群霍亂弧菌的非診斷性方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210067180.6
• 申請(qǐng)日: 2012-03-14
• 公開（公告）號(hào): CN102676653A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓輝;徐寶梁;楊宇;李海山;周蕾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/63
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11003
• 代理人: 尹振啟

1.一種雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)O1群和O139群霍亂弧菌的非診斷性方法，其特征在于，該非診斷性方法包括：

針對(duì)O1群和O139群弧霍亂弧菌的O抗原合成基因rfb基因設(shè)計(jì)引物和探針：

2.如權(quán)利要求1所述的非診斷性方法，其特征在于，所述探針O1-P和O139-P的5’端所標(biāo)記熒光素分別為FAM和HEX，探針3’端均連接淬滅基團(tuán)；所述該淬滅基團(tuán)為BHQ1非熒光淬滅基團(tuán)。

3.如權(quán)利要求1所述的非診斷性方法，其特征在于，所述該非診斷性方法包括步驟：

1)提取細(xì)菌染色體DNA；

2)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)，配制一定組分濃度的20μL?PCR反應(yīng)體系，混勻后短暫離心分裝到PCR管中；

3)將待測(cè)樣品加入到反應(yīng)體系中，進(jìn)行擴(kuò)增；

4)在退火階段收集熒光信號(hào)，檢測(cè)Ct值。

4.如權(quán)利要求3所述的非診斷性方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的體系組分及其體積如下：

循環(huán)條件：

5.如權(quán)利要求3所述的非診斷性方法，其特征在于，所述O1群和O139群弧霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)品制備的具體步驟包括：

1)根據(jù)所設(shè)計(jì)的O1群和O139群弧霍亂弧菌引物，分別擴(kuò)增O1群和O139群弧霍亂弧菌全測(cè)序菌株N16961和MO45的純培養(yǎng)液DNA模板；

2)按照膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段；

3)制備O1群和O139群弧霍亂弧菌rfb基因克隆子；

4)提取O1群和O139群弧霍亂弧菌質(zhì)粒后進(jìn)行插入片段的限制性酶切分析，取呈陽性的酶切反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行克隆質(zhì)粒測(cè)序?qū)嶒?yàn)；

5)O1群和O139群弧霍亂弧菌質(zhì)粒DNA的濃度換算為拷貝數(shù)后，將質(zhì)粒稀釋成若干個(gè)濃度梯度備用。

6.如權(quán)利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述O1群和O139群弧霍亂弧菌全測(cè)序菌株N16961和MO45的純培養(yǎng)液DNA模板的擴(kuò)增條件為：

7.如權(quán)利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述用膠回收純化的DNA片段制備O1群和O139群弧霍亂弧菌rfb基因克隆子，配制的連接反應(yīng)體系為：

8.如權(quán)利要求7所述的非診斷性方法，其特征在于，所述O1群和O139群弧霍亂弧菌rfb克隆子制備時(shí)，用O1F/O1R和O139F/O139R對(duì)涂有Amp100的營養(yǎng)瓊脂平板上生長的菌落進(jìn)行擴(kuò)增鑒定。

9.如權(quán)利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述酶切反應(yīng)體系如下：

10.如權(quán)利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述雙酶切鑒定呈陽性的克隆質(zhì)粒上機(jī)測(cè)序，序列結(jié)果與已知目的序列進(jìn)行比對(duì)；所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的體系中對(duì)O1群和O139群弧霍亂弧菌質(zhì)粒的檢測(cè)下限均為1.0×10²拷貝/μl。