[發明專利]一種用于護唇類化妝產品中沙門菌的檢查方法與驗證

無效

• 申請號: 201210064680.4
• 申請日: 2012-03-13
• 公開（公告）號: CN102533931A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 張丹;劉海靜;王嫦鶴;李濤;楊靜
• 申請（專利權）人: 陜西省食品藥品檢驗所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/42
• 代理公司: 西安文盛專利代理有限公司 61100
• 代理人: 彭冬英

1.一種用于護唇類化妝產品中沙門菌的檢查方法與驗證，其特征在于：所述的檢測步驟如下：

1.1菌液制備方法??按《中國藥典》2010年版二部附錄微生物限度檢查試驗菌液的制備方法，取經30～35℃培養18～24小時的沙門菌營養肉湯新鮮培養物1ml，加入9ml質量體積百分比0.9％的無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋制成10～100cfu的菌懸液備用；

1.2試驗組

1.2.1前增菌和增菌??取供試品10g，加入無菌聚山梨酯-80和無菌液體石蠟各10ml，研磨至粘稠狀后加入70ml胰酪胨大豆肉湯培養基中混勻溶解，再加入試驗用沙門氏菌懸液10～100cfu?1ml于36±1℃18～24小時培養，取10ml培養物加四硫磺酸鈉煌綠增菌培養基(TTB)至100ml，42℃培養18～24小時；另取10ml培養物加氯化鎂-孔雀綠沙氏增菌培養基(RVS)至100ml，36±1℃培養18～24小時；

1.2.2分離??取上述兩種增菌培養物各1環，接種于1個亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)和1個Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)平板上，36±1℃分別培養40～48小時(BS)和18～24小時(HE)，觀察各平板上生長的菌落，結果Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)平板上生長的菌落中心為黑色，亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)平板上生長的菌落為黑色且有金屬光澤，菌落周圍培養基為棕色或黑色；

1.2.3初步鑒定試驗??從Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)和亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)平板上各挑取2～3個菌落至三糖鐵(TSI)瓊脂斜面培養基上穿刺劃線培養18～24小時，觀察結果，Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)和亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)平板上的培養物在三糖鐵(TSI)瓊脂斜面培養基上底層均為黑色，斜面和底層為黃色均產H₂S氣；

1.2.4鏡檢??挑取三糖鐵(TSI)瓊脂斜面培養基上生長的疑似單個菌落接種至營養瓊脂培養基平板上，于36±1℃?18～24小時培養，做革蘭染色鏡檢，觀察，結果為革蘭染色陰性無芽孢短桿菌；

1.2.5生化試驗

(1)靛基質試驗??挑取少量TSI三糖鐵瓊脂斜面上的培養物，接種于蛋白胨水培養基4ml/管中，于36±1℃培養1～2天，必要時可延長至4～5天，加入柯凡克試劑約0.5ml，輕搖，觀察結果，試劑層呈無色；

(2)尿素酶試驗??挑取少量TSI三糖鐵瓊脂斜面上的培養物，接種于尿素瓊脂斜面培養基上，于36±1℃培養24小時，觀察結果，培養基未產堿變色；

(3)氰化鉀及對照試驗??挑取少量TSI三糖鐵瓊脂斜面上的培養物，接種至營養肉湯培養基管中，于36±1℃培養24小時，再用接種環挑取一環接種于氰化鉀及不含氰化鉀基礎培養基(對照管)各1管，塞緊管口；于36±1℃培養1～2天，觀察結果，實驗管澄清，對照管渾濁；

(4)賴氨酸脫羧酶及對照試驗??挑取少量TSI三糖鐵瓊脂斜面上的培養物，接種賴氨酸脫羧酶及不含賴氨酸的基礎培養基(對照管)各1管，4ml/管，培養18～24小時，觀察結果，實驗管培養基呈紫色，對照管培養基呈黃色；

以上生化實驗結果為：靛基質試驗呈陰性，尿素酶試驗呈陰性，氰化鉀試驗實驗管陰性、對照管陽性，賴氨酸脫羧酶試驗實驗管陽性、對照管陰性，以上試驗均符合典型的沙門菌屬的生化反應且特征一致；

1.2.6血清凝集試驗??取1滴A～F多價血清滴于載玻片上，從上述三糖鐵(TSI)瓊脂斜面培養基上穿刺劃線培養的新鮮培養物中挑取少許菌落與血清涂抹混勻，常溫下放置3分鐘后觀察結果均產生凝集，呈陽性反應，同時對出現凝集的待檢菌落培養物用無菌生理鹽水替代血清與培養物混勻作對照試驗，結果對照無凝集現象，為血清凝集陰性反應；

1.3陽性組

1.3.1前增菌和增菌試驗??取無菌聚山梨酯-80和無菌液體石蠟各10ml，研磨至粘稠狀后加入70ml胰酪胨大豆肉湯培養基中混勻，再加入試驗用沙門菌液10～100cfu?1ml于36±1℃??18～24小時培養，取10ml培養物加四硫磺酸鈉煌綠增菌培養基(TTB)至100ml，42℃培養18～24小時；另取10ml培養物加氯化鎂-孔雀綠沙氏增菌培養基(RVS)至100ml，36±1℃培養18～24小時；

1.3.2分離??取上述兩種增菌培養物各1環，接種于1個亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)和1個Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)平板上，36±1℃分別培養40～48小時(BS)和18～24小時(HE)，觀察各平板上生長的菌落，結果Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)平板上生長的菌落中心為黑色，亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)平板上生長的菌落為黑色且有金屬光澤，菌落周圍培養基為棕色或黑色；

1.3.3初步鑒定試驗??從Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)和亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)平板上各挑取2～3個菌落至三糖鐵(TSI)瓊脂斜面培養基上穿刺劃線培養18～24小時，觀察結果，Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)和亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)平板上的培養物在三糖鐵(TSI)瓊脂斜面培養基上底層均為黑色，斜面和底層為黃色均產H₂S氣；

1.3.4鏡檢??挑取三糖鐵(TSI)瓊脂斜面培養基上生長的疑似單個菌落接種至營養瓊脂平板上于36±1℃??18～24小時培養，做革蘭染色鏡檢，觀察，結果為革蘭染色陰性無芽孢短桿菌；

1.3.5生化試驗

(1)靛基質試驗??挑取少量TSI三糖鐵瓊脂斜面上的培養物，接種于蛋白胨水培養基4ml/管中，于36±1℃培養1～2天，必要時可延長至4～5天，加入柯凡克試劑約0.5ml，輕搖，觀察結果，試劑層呈無色；

(2)尿素酶試驗??挑取少量TSI三糖鐵瓊脂斜面上的培養物，接種于尿素瓊脂斜面培養基上，于36±1℃培養24小時，觀察結果，培養基未產堿變色；

(3)氰化鉀及對照試驗??挑取少量TSI三糖鐵瓊脂斜面上的培養物，接種至營養肉湯培養基管中，于36±1℃培養24小時，再用接種環挑取一環接種于氰化鉀及不含氰化鉀基礎培養基(對照管)各1管，塞緊管口；于36±1℃培養1～2天，觀察結果，實驗管澄清，對照管渾濁；

(4)賴氨酸脫羧酶及對照試驗??挑取少量TSI三糖鐵瓊脂斜面上的培養物，接種賴氨酸脫羧酶及不含賴氨酸的基礎培養基(對照管)各1管，4ml/管，培養18～24小時，觀察結果，實驗管培養基呈紫色，對照管培養基呈黃色；

以上生化實驗結果為：靛基質試驗呈陰性，尿素酶試驗呈陰性，氰化鉀試驗實驗管陰性、對照管陽性，賴氨酸脫羧酶試驗實驗管陽性、對照管陰性，以上試驗均符合典型的沙門菌屬的生化反應且特征一致；

1.3.6血清凝集試驗??取1滴A～F多價血清滴于載玻片上，從上述三糖鐵(TSI)瓊脂斜面培養基上穿刺劃線培養的新鮮培養物中挑取少許菌落與血清涂抹混勻，常溫下放置3分鐘后觀察結果均產生凝集，呈陽性反應，同時對出現凝集的待檢菌落培養物用無菌生理鹽水替代血清與培養物混勻作對照試驗，結果對照無凝集現象，為血清凝集陰性反應；

1.4陰性組

1.4.1前增菌和增菌??分別取無菌聚山黎脂-80和無菌液體石蠟各10ml，研勻加至70ml胰酪胨大豆肉湯培養基中于36±1℃?18～24小時培養，取10ml培養物加四硫磺酸鈉煌綠增菌培養基(TTB)至100ml，42℃培養18～24小時；另取10ml培養物加氯化鎂-孔雀綠沙氏增菌培養基(RVS)至100ml，36±1℃培養18～24小時；

1.4.2分離??取上述培養物各1環，接種于1個亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)和1個Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)平板，于36±1℃分別培養40～48小時(BS)和18～24小時(HE)，觀察，亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)和Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)平板均未有菌落生長，結果為陰性反應；

1.5樣品組

1.5.1前增菌和增菌??取供試品10g，再分別取無菌聚山梨脂-80和無菌液體石蠟各10ml，研勻加至70ml胰酪胨大豆肉湯培養基中于36±1℃18～24小時培養；取10ml培養物加四硫磺酸鈉煌綠增菌培養基(TTB)至100ml，42℃培養18～24小時；另取10ml培養物加氯化鎂-孔雀綠沙氏增菌培養基(RVS)至100ml，36±1℃培養18～24小時；

1.5.2分離??取上述培養物各1環，接種于1個亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)和1個Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)平板，于36±1℃分別培養40～48小時(BS)和18～24小時(HE)，觀察，亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)和Hektoen-腸道瓊脂培養基(HE)平板均未有菌落生長，結果為陰性反應。