[發明專利]中國北方大腸癌患者hMLH1基因的新突變及其用途

無效

• 申請號: 201210057690.5
• 申請日: 2012-03-07
• 公開（公告）號: CN102643823A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 胡付蘭;王帆;李丹丹;王彝白納;姚曉萍
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及中國北方散發大腸癌患者的hMLH1基因的一種新的突變類型。屬于分子檢測領域。

背景技術

hMLH1基因是大腸癌患者的致病基因之一。自Papadopoulos?N等人1993年在Lynch?syndrome大腸癌患者中發現了hMLH1基因突變后，國內外大部分文獻報道了hMLH1基因在Lynch?syndrome大腸癌中的突變位點，只有少部分文獻報道了hMLH1基因在散發大腸癌中的突變位點。但hMLH1基因在中國北方散發大腸癌患者中的突變無人報道，尤其是在一例散發大腸癌患者中新發現的突變(c.704GAT＞GTT(p.Asp235Val))在國內外均未見報道。

發明內容

本發明在已報道hMLH1基因突變基礎上更豐富了hMLH1基因在大腸癌患者中的突變譜。為大腸癌患者的分子診斷和治療提供了理論基礎。

本發明的發明人在342例散發大腸癌患者中開展了hMLH1基因外顯子1-19、hMSH2基因外顯子1-16、k-ras基因12和13密碼子、Braf基因11、15外顯子和PI3K基因9、20外顯子的突變篩檢，在1例散發大腸癌患者中發現了hMLH1基因外顯子9的一種新的突變類型。而該病例未攜帶其它與散發大腸癌有關的基因突變。

在現有研究的基礎上，本發明提出了一種分離的突變hMLH1基因或其片段，其特征在于所述的基因或其片段的cDNA序列是在GeneBank登錄號為NM_000249.3所示的序列基礎上發生以下突變：c.704GAT＞GTT(p.Asp235Val)。(cDNA堿基位置的命名是從ATG開始)。

所述的突變hMLH1基因的cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明還提供了一種用于擴增權利要求1或2所述的突變hMLH1基因或其片段的引物。

優選的，所述的引物序列如下所示：

上游F：5’-CAGGAGGACCTCAAATGGACC-3’

下游R：5’-GTTGATGAAGAGTAAGAAGATGC-3’

進一步的，本發明還提供了一種用于檢測所述的突變hMLH1基因或其片段的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中包括以上所述的引物。

優選的，所述的試劑盒中包括的引物序列如下所示：

上游F：5’-CAGGAGGACCTCAAATGGACC-3’

下游R：5’-GTTGATGAAGAGTAAGAAGATGC-3’

更進一步的，本發明提出了所述的引物在制備診斷或檢測中國北方大腸癌患者hMLH1基因試劑中的應用。及

所述的試劑盒在制備診斷或檢測中國北方大腸癌患者hMLH1基因試劑中的應用。

本發明的是通過以下技術方案實現的：

(1)采用經典的飽和酚氯仿的方法提取組織樣本DNA。

(2)設計需要擴增的hMLH1基因外顯子9的引物。

(3)配制25μl?PCR擴增體系，并進行PCR擴增。

(4)瓊脂糖凝膠電泳

配制1％瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖粉，加入到1.0×TBE電泳液中。PCR產物在100V的條件下電泳30-40分鐘。電泳結束后于紫外燈下觀察結果。若在目的片段大小的位置出現條帶則PCR成功，可以進行下一步的聚丙烯酰胺凝膠電泳。

(5)聚丙烯酰胺凝膠電泳

①制備玻璃板架：將兩塊玻璃板平放，玻璃板之間的三邊插入膠條，三周用夾子夾緊，斜放在架子上。

②配制濃度為12％的聚丙烯酰胺凝膠用500ml量筒量取243.8ml雙蒸水至1000ml大燒杯中；用100ml和500ml量筒分別量取40ml?10×TBE、192ml?30％聚丙烯酰胺至已加入雙蒸水的大燒杯中，分別用移液管和移液器吸取4ml?10％過硫酸胺、200μl?TEMED至大燒杯中，用玻璃棒充分攪拌混勻。

③加樣：將上述配好的混合液用玻璃棒引流至已經夾好的玻璃板之間，插入梳子。將制好的聚丙烯酰胺膠連帶玻璃板夾固定在電泳槽上，倒入約400mL1×TBE。將準備好的電泳槽連接到電泳儀上，300伏預電泳30分鐘。將變性buffer與PCR產物按照5∶1的比例至10μl體積混勻離心。98℃變性10分鐘，將變性后的PCR產物迅速冰浴。將PCR產物用微量加樣器加入上樣孔。

④電泳：將電泳槽放入4℃冰箱。300伏電泳5分鐘，150伏電泳過夜。