[發明專利]一種同時檢測玉米和花生中四種真菌毒素的懸浮芯片檢測方法

無效

• 申請號: 201210055729.X
• 申請日: 2012-03-06
• 公開（公告）號: CN103308687A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 高志賢;王瑩;寧保安;呂志強;孫智勇;柳明;彭媛;范獻軍;董建偉;周彩虹
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種多真菌毒素定量檢測的懸浮芯片方法，由羧基化微球、偶聯于微球上的蛋白檢測指標及其對應的單抗指標等組成。其特征在于，所述微球表面的蛋白檢測指標包括：黃曲霉毒素總量、嘔吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮四種真菌毒素的完全抗原，均通過EDC法共價偶聯于羧基化的微球表面。

2.權利要求書1所述的羧基化微球是一種直徑為5.6μm的聚苯乙烯微球，微球帶有兩種熒光物質，根據兩種熒光物質的濃度配比不同，可以將微球分成100種。微球表面上的羧基通過EDC法與蛋白檢測指標上的氨基進行共價結合，且是液相反應體系，有利于保持蛋白分子的生物活性。

3.根據權利要求1所述的四種真菌毒素的完全抗原，即四種小分子與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯物，依次為：黃曲霉毒素總量完全抗原(AFT-BSA)、嘔吐毒素完全抗原(DON-BSA)、T-2毒素完全抗原(T-2-BSA)和玉米赤霉烯酮完全抗原(ZEN-BSA)。

4.根據權利要求1所述的小分子鼠源單克隆抗體依次為：抗黃曲霉毒素總量單克隆抗體(AFT-Ab)、抗嘔吐毒素單克隆抗體(DON-Ab)、抗T-2毒素單克隆抗體(T-2-Ab)、抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體(ZEN-Ab)。

5.根據權利要求3所述的四種真菌毒素半抗原依次是黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)、T-2毒素(T-2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)。

6.制備權利要求1所述懸浮芯片法中各完全抗原與微球偶聯包括以下步驟：

(1)將空白的羧基化微球從4℃冰箱取出，于暗環境中將其恢復至室溫，再將其進行活化；

(2)按實驗設計的濃度配制各完全抗原溶液，通過EDC法與羧基化微球偶聯，即各完全抗原與微球的偶聯物，并對其進行封閉；

(3)將偶聯物渦旋振蕩后，用懸浮芯片儀對其進行讀數。其余的用鋁箔紙包裹，于4℃儲存。

注：本發明的所有操作過程均在暗環境下進行。

7.根據權利要求5，進行懸浮芯片實驗時，應先將偶聯物和懸浮芯片所用的各種緩沖液從4℃冰箱取出，恢復至室溫后啟用。

8.本發明所采用的是間接競爭免疫反應，主要分為五個階段的工作：

(1)四種真菌毒素完全抗原分別與不同編碼微球的偶聯；

(2)四種真菌毒素單抗和生物素化二抗最佳工作濃度的確定，以及抗原抗體之間特異性的驗證；

(3)同時檢測四種真菌毒素時多通道標準曲線的建立；

(4)同時檢測玉米、花生中四種真菌毒素懸浮芯片方法的建立；

(5)懸浮芯片法檢測玉米、花生的準確性和重復性研究。

9.根據權利要求8中(2)，按設定的濃度配制各單抗與生物素化二抗的工作濃度溶液，進行棋盤優化，得出各抗體最佳的工作濃度，并對各抗原抗體進行特異性檢測。

10.根據權利要求8中(3)，按照優化后的各抗體最佳的工作濃度溶液進行配制，并按設定的一系列濃度配制各半抗原的混合溶液，使其與完全抗原競爭有限的抗體結合位點，繪制出同時檢測四種真菌毒素的多通道標準曲線。

11.根據權利要求8中(4)，將從當地市場購得的玉米和花生樣品用一定比例的甲醇/水溶液進行前處理，并將陰性提取液進行稀釋。以此玉米陰性樣液和花生陰性樣液為稀釋液，按最佳工作濃度配制抗體溶液，以及一系列濃度的半抗原混合液，使其與相應偶聯物進行競爭免疫反應，以繪制出玉米和花生中檢測四種真菌毒素的多通道標準曲線，通過對MFI₀(陽性對照)和IC₅₀進行比較分析，從而對基質效應進行評價。

12.根據權利要求8中(5)，通過對實際樣品的加標檢測結果進行分析，評價檢測的重復性和準確性，從而得出懸浮芯片法可同時檢測玉米和花生樣品中的四種真菌毒素。