[發明專利]基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法

無效

• 申請號: 201210054091.8
• 申請日: 2012-03-02
• 公開（公告）號: CN102608177A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 李麗東;牟曉姣;陳鄭博;林麗娟
• 申請（專利權）人: 北京航空航天大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 北京永創新實專利事務所 11121
• 代理人: 姜榮麗

技術領域

本發明屬于生物傳感器領域，具體涉及一種基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法。

背景技術

凝血酶是一種多功能絲氨酸蛋白酶，在生物體內一系列生理和病理過程中起重要作用。它不但參與止血和凝血、炎癥、免疫反應、組織修復和創傷愈合，而且可激活正常細胞的致瘤潛能和導致惡性細胞的轉移表型。隨著現代社會的發展，人們的物質生活水平不斷提高，但隨之而來的是各種疾病的侵襲。而這其中有很大一部分是心血管及腦部疾病，由于現在的檢測技術有限，使很多可以治愈的疾病失去了最佳治療期，從而造成不可挽回的后果。新近的研究表明，血凝塊產生的凝血酶在這些過程中起著關鍵作用。從而為腦出血的治療及研究提供了可能。

參考文獻[1]Chunhai?Fan，Kevin?W.Plaxco，and?Alan?J.Heeger.Electrochemical?interrogation?of?conformational?changes?as?a?reagentless?method?for?the?sequence-specific?detection?of?DNA.Applied?Biological?Sciences，2003，100(16)，9134-9137中記載，Plaxco?K.W等人分別利用亞甲藍標記的2個含堿基數不同的凝血酶適體構建了信號抑制型(信號抑制)和信號放大型(信號增益)的電化學傳感器，將亞甲藍標記的帶32個堿基的凝血酶適體通過自組裝作用固定在金電極表面。當未加入凝血酶時，適體呈隨意的卷曲狀態，亞甲藍離電極的距離近，電子傳遞能力強，電流信號較大；當加入凝血酶，適體折疊與凝血酶特異性結合形成G-四聚體椅狀構象，亞甲藍離電極表面的距離變遠，電子傳遞能力減弱，電流信號顯著降低，即為信號抑制型，檢出限為6.4nmol/L。信號抑制型的優點是電極的表面可以更新，缺點是會檢測到由于污染引起的假陽性結果。隨后，他們又設計了信號增益型：通過巰基自組裝作用將27個堿基的適體固定在金電極表面，與另一條部分互補的標記亞甲藍DNA鏈雜交(21個堿基)，雜交后，亞甲藍距離電極表面較遠，電子傳遞能力弱，亞甲藍的還原電流很小；當加入凝血酶后，凝血酶與適體強烈的結合力使雜交雙鏈部分解離，亞甲藍離電極表面的距離變近，亞甲藍的還原電流增大。該法測定的靈敏度為3nmol/L。信號增益型克服了信號抑制型可能會檢測到的假陽性結果，提高了檢測的靈敏度。

而基于光信號、pH信號、離子信號等的離子通道，也是當今一大熱門研究的方向。參考文獻[2]Correll?B?A，Breach?L?B，King?L?G，et?al.[J].Nature，1997，387：580-583中記載，Correll等人在1997年研制出了一種新型的基于BLM的離子通道開關(ion-channel?switch，ICS)生物傳感器。該傳感器在穩定性、靈敏度、選擇性、可靠性等方面均有很大提高，通過改變受體的性質和類型，可用于血型分析，檢測細菌、病毒、DNA、藥物、抗體及電解質等，但是靈敏度和檢測限都遠遠不能滿足現有技術發展的需求。

發明內容

本發明的目的是結合離子通道和傳統的電極上的基于適配體生物傳感器，使得適配體在電極上的修飾成為三維立體，脫離傳統的二維平面的修飾。另外借助離子通道的開關概念，使得檢測具有仿生和智能的性質。制備出機理為信號增益的檢測凝血酶的生物傳感器，達到信號放大的效果。本發明可以達到很低的檢測限(1pM)和非常好的選擇性，在實際樣品中也有很好的應用。

本發明提供的基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法，具體步驟如下：

第一步：離子通道的制備：將刻蝕液9M?NaOH溶液滴在PET膜一面上，在35攝氏度的溫度下，進行刻蝕。通過控制時間的長短可控制離子通道孔徑的大小。通常刻蝕30分鐘，此時的孔徑用電子顯微鏡測試后，約150nm～200nm。刻蝕完畢后，浸泡在1M?HCOOH阻止溶液中30分鐘。洗凈放入去離子水中待用。

第二步：DNA適配體的配置與準備：在PBS(phosphate?buffer?solution)緩沖溶液中加入DNA適配體，形成DNA適配體溶液，DNA適配體溶液放置在90攝氏度水浴下5分鐘，然后自然冷卻到常溫。使用前放置在-20攝氏度條件下保存。

第三步：P-ATP(對巰基苯胺)的配置：以無水乙醇為溶劑，向溶劑中加入P-ATP，得到含有10mM的P-ATP的乙醇溶液，該乙醇溶液在使用前配置，密封保存，以免液體揮發。