[發(fā)明專(zhuān)利]免疫親和沉淀法純化抗體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210054083.3
• 申請(qǐng)日: 2012-03-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102942627A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-02-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賀佑豐;袁鵬飛;呂東川;谷澤亮;張庚寬;王丁泉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京北方生物技術(shù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/00
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/00;C07K1/32
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明是一種免疫化學(xué)方面的抗體純化新方法，主要涉及免疫化學(xué)的研究和醫(yī)藥衛(wèi)生的生產(chǎn)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在許多免疫化學(xué)的研究和醫(yī)藥衛(wèi)生的生產(chǎn)過(guò)程中，常常需要免疫親和層析級(jí)別的純化抗體。為了得到親和力好、特異性強(qiáng)、純度高的抗體，現(xiàn)在常用的純化方法是免疫親和層析法。免疫親和層析法的過(guò)程是：一般情況下，先用偶聯(lián)劑溴化氰(CNBr，有劇毒，操作時(shí)需要防護(hù))將抗原連接到固相載體——瓊脂糖凝膠(Sepharose?4B或6B)上作為免疫吸附劑，然后將免疫吸附劑裝入層析柱中，用淋洗液洗去未被連接的抗原和連接劑后，即可上樣待純化的抗體混合物，當(dāng)混合物中的抗體與免疫吸附劑上連接的抗原靠近時(shí)，抗原抗體會(huì)產(chǎn)生特異性結(jié)合，形成抗體-免疫吸附劑結(jié)合物，從而將需要純化的抗體暫時(shí)地特異固定在免疫吸附劑上，混合液中的其他組份則游離在液相中，充分反應(yīng)后，淋洗除去未結(jié)合的其他混合物，淋洗完的層析柱上只留下單一的抗體-免疫吸附劑結(jié)合物，最后，再通過(guò)改變pH值，解離抗原和抗體的結(jié)合，從而洗脫下親和力好、特異性強(qiáng)、純度高的抗體。

免疫親和層析法用于純化抗體時(shí)存在的缺點(diǎn)：①制備免疫吸附劑時(shí)，要使用偶聯(lián)劑溴化氰，該化合物有劇毒，操作時(shí)要特殊防護(hù)；②經(jīng)活化的瓊脂糖凝膠比較昂貴，生產(chǎn)制備時(shí)購(gòu)置成本高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明采用免疫親和沉淀法純化抗體：首先，采用以丙烯酰胺和丙烯酸為單體的共聚物固相微球(該微球是圓球狀，直徑為2～5μm，可懸浮于水溶液中)作為固相載體，這種固相載體上含有羧基(-COOH)，將含有氨基(-NH₂)的抗原與固相載體混合，再加入偶聯(lián)劑——1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)，室溫震蕩反應(yīng)過(guò)夜，EDC能使羧基和氨基脫水形成酰胺鍵，從而將抗原連接到固相載體上，形成了抗原-固相載體的免疫吸附劑。通過(guò)離心洗滌，除去未被連接上的抗原和其他混合物后，得到單一的免疫吸附劑。然后，將待純化的抗體原液與免疫吸附劑混合，2～8℃放置過(guò)夜，抗原抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，形成抗體-免疫吸附劑結(jié)合物，通過(guò)離心洗滌，除去未結(jié)合的其他混合物，得到單一的抗體-免疫吸附劑結(jié)合物，再降低體系中的pH值，則抗體就會(huì)被解離到溶液中，通過(guò)離心分離上清后立即用堿性溶液調(diào)整上清液的pH值到中性，此上清經(jīng)透析后即為純化的抗體溶液。免疫吸附劑通過(guò)離心洗滌后懸浮于免疫吸附劑保存液中，2～8℃放置，可重復(fù)用于純化抗體。免疫吸附劑保存液的組份為：0.02M?PB(磷酸鹽緩沖溶液，pH7.4)、0.9％NaCl、0.1％NaN₃。

本發(fā)明所用的固相載體制備成本低。抗原和固相載體的偶聯(lián)劑是碳二亞胺(EDC)，無(wú)毒性。連接過(guò)程為室溫震蕩過(guò)夜，非常簡(jiǎn)便。抗體的純化過(guò)程，采用的是最常用的離心方法，一次可大批量制備。而且，免疫吸附劑經(jīng)純化抗體后，還可重復(fù)使用，2～8℃下也可長(zhǎng)期保存。所以，本發(fā)明建立了一種操作簡(jiǎn)便、不操作劇毒物、制備成本低廉、適合大量生產(chǎn)、可用于制備純度達(dá)到免疫親和層析級(jí)別抗體的方法。

本發(fā)明操作步驟如下：

1、抗原的準(zhǔn)備：用于本發(fā)明的抗原需要有氨基(-NH₂)，一般的蛋白質(zhì)抗原都有氨基，經(jīng)過(guò)純化后即可使用。

2、固相載體的準(zhǔn)備：固相載體在偶聯(lián)前，一般需要先用0.01MPB(pH7.4)的緩沖液離心洗滌3次，用以除去懸浮液中的雜物。本發(fā)明中的通用離心條件為：離心機(jī)轉(zhuǎn)速要求不小于每分鐘3500轉(zhuǎn)，離心時(shí)間不小于10分鐘，洗滌時(shí)每次用不小于10倍固相載體體積的0.01MPB(pH7.4)的緩沖液。

3、固相載體與抗原的連接：將固相載體和抗原(加入前測(cè)抗原的濃度)共同混合于0.01MPB(pH7.4)的緩沖液中，再加入EDC的水溶液，于室溫下震蕩反應(yīng)過(guò)夜。因?yàn)楣滔噍d體上含有羧基，羧基在EDC的作用下可與抗原上的氨基共價(jià)連接，從而使得固相載體和抗原產(chǎn)生穩(wěn)定的共價(jià)連接形成了免疫吸附劑。固相載體與抗原連接后，離心，測(cè)上清抗原濃度，從而可計(jì)算免疫吸附劑上連接的抗原量。然后，再對(duì)免疫吸附劑離心洗滌至上清A_280nm(溶液在280nm紫外光下的光吸收值)＜0.02。洗滌完后，免疫吸附劑用等體積左右的0.01MPB(pH7.4)的緩沖液懸浮。

4、免疫吸附劑與抗體的結(jié)合：取一定體積的待純化抗體原液直接加入到免疫吸附劑懸浮液中，2～8℃放置過(guò)夜。次日，離心，沉淀物即為抗體-免疫吸附劑，除去上清，將抗體-免疫吸附劑離心洗滌至上清A_280nm＜0.02。