[發明專利]一種適合葉際細菌和真菌PCR擴增的簡便、高效DNA提取方法

無效

• 申請號: 201210053974.7
• 申請日: 2012-03-05
• 公開（公告）號: CN103289987A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 馬安周;潘建剛;齊鴻雁;莊國強;白志輝
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于環境微生物領域，主要是針對研究棉花葉際細菌和真菌多樣性研究而改進的DNA提取方法。?

技術背景

植物的葉際是一個復雜的生態系統，雖然微生物的生存環境條件嚴苛，但是植物葉際卻有著豐富的微生物多樣性。其中存在著許多對植物有益的細菌群落，包括生防細菌、產植物生長激素細菌及固氮菌等。它們通過和植物寄主的互作，改善著葉際微生物的棲居環境。此外，在植物的葉際也存在著大量的有益真菌，它們在在碳素循環和氮素循環以及增強植物的抗病性等方面起著重要作用。目前，大量轉基因植物的種植和農藥的噴施以及納米材料的應用，在給農業帶來巨大利益的同時，其對生態環境和生物多樣性的負面影響也越來越受到人們的關注。葉際微生物作為一種生態學指標在生態穩定與環境安全評價中開始發揮顯著的作用。?

葉際微生物的生物多樣性和功能受多重因子(如氣候因子的變化、植物種類、發育階段的不同)的影響。因此，這為原位測定葉際微生物生物多樣性、揭示葉際微生物生物多樣性與生態功能的關系以及植物-微生物的互作關系帶來了巨大的挑戰。但是分子生物學技術的快速發展，又必定會使葉際微生物生態的研究取得突破性進展。?

基于此，本專利是在研究轉Bt棉花對葉際非標靶微生物影響的基礎上，建立起適合葉際真菌和細菌PCR擴增的簡便、高效的DNA提取方法。?

實驗表明，該DNA提取方法能同時滿足對棉花葉際固有細菌和真菌的PCR擴增。利用引物338f和518r(能有效擴增細菌16SrRNA?V3區)、以及NS1和GCfung(能有效擴增真菌18SrRNA?部分V1和V2區)、NS1和FR1(能有效擴增真菌18SrRNA?的1650bp)都獲得了較好的擴增效果。充分說明該提取方法能同時滿足對植物葉際固有細菌和真菌的PCR擴增。目前尚無利用該DNA提取方法研究植物葉際微生物多樣性的文獻報道。?

發明內容

本發明的目的是建立一種簡便、高效提取葉際微生物總DNA的提取方法，能同時滿足對葉際細菌和真菌進行有效擴增，進行相關的研究。該方法是一種簡單、易行而且提取效率較高的DNA提取方法，可以直接用于葉際細菌和真菌的PCR擴增。?

1、棉花葉際微生物的采集處理?

取10g來源于不同棉花植株的葉片樣品，用含有少許吐溫-80的無菌磷酸緩沖液(pH7.5)經超聲波震蕩(40KHz)洗滌葉際微生物細胞，最后離心收集菌體。?

2、DNA的提取?

3、16SrDNA?V3區與18SrRNA?V1和V2區部分的擴增檢驗?

選用合適的引物PCR擴增細菌16SrDNA和真菌18SrRNA的部分區段，結果表明該方法能同時滿足葉際細菌和真菌的PCR擴增。

附圖說明

圖1是一些棉花葉際DNA提取效果圖；圖2是利用細菌通用引物338f-518r擴增的效果圖；圖3是利用真菌通用引物NS1-Gcfung擴增的效果圖。?

具體實施方式

本發明所提供的DNA提取方法是在分析棉花葉際真菌和細菌多樣性的研究中建立起來的。其具體步驟如下：?

1、葉際微生物的分離和收集：?

每次取10g來源于不同棉花植株的葉片樣品，并將其加入盛有300mL無菌的磷酸緩沖液(pH?7.5)中三角瓶中，此后向樣品洗滌液中加入8滴濃度為20％的吐溫-80溶液。用超聲波震蕩(40KHz)8min。按著在無菌操作下用鑷子取出葉片樣品，13,000g離心8分鐘收集菌體。?

2、DNA提取：?

將10g油菜葉際收集的菌體沉淀置于盛有0.7g玻璃珠的2ml離心管里，并向其中加1mL?DNA提取緩沖液，之后利用Fast?prep振蕩器在最大速度下振蕩45s；向離心管里加300ul?20％SDS，60℃水浴1小時，期間輕輕搖動；之后再加60ul蛋白酶K，37℃溫浴30分鐘，期間輕輕搖動；在1,0000g離心10min，收集上清液；向上清液中加等體積的酚氯仿抽提，12000g離心8分鐘，收集上層水相(重復兩次)：將2/3倍體積的異丙醇到上清液中，-20℃靜置1.25小時，13,000g離心15分鐘，收集沉淀。用預冷的70％乙醇洗兩次后，于超凈工作臺自然晾干，加50μl超純水溶解DNA沉淀，備用。?

3、以下圖片是利用本方法提取的葉際DNA的效果圖以及PCR擴增圖。?